材料和试剂

材料
1. 15毫升和50毫升猎鹰管（猎鹰，目录号：352097,352098）
2. 1.5毫升和2毫升离心管（Eppendorf，目录号：0030120086,0030120094）
3. 96孔，24孔和6孔组织培养板（Corning，目录号：3599,3524,3516）
4. T25，T75和T175组织培养瓶（Thermo scientific，目录号：156367,156499,159910）
5. 1毫升，5毫升，10毫升和25毫升一次性塑料血清移液器（康宁，目录号：4012,4051,4101,4251）
6. 移液器吸头（10,200和1,000μl）（BBI，目录号：F602215-0001，; F604224-0001，F600222-0001）
7. 0.22μm和0.45μm一次性无菌过滤器（Millipore，目录号：SLGV033RB，SLHV033RS）
8. 1.5毫升低温小瓶（Nalgene，目录号：5000-1020）和冷冻储存架
细胞
1. 人类诱导的多能干细胞（hiPSCs，在我们的实验室中产生）
2. 人胚胎干细胞（H9，hESCs）（WiCel研究所，目录号：WA09;来自奥胡斯大学罗永伦副教授的礼物）
3. 人BM-MSC（hBM-MSC，LONZA，目录号：PT-2501）
抗体
注意：抗体用于验证MSC表面抗原。
1. APC Mouse Anti-Human CD34（BD，目录号：560940）
2. V450鼠标抗人类CD45（BD，目录号：560368）＆nbsp;
3. PE Mouse Anti-Human CD73（BD，目录号：561014）
4. FITC Mouse Anti-Human CD90（BD，目录号：555595）
5. PerCP-Cy5.5小鼠抗人CD105（BD，目录号：560819）
试剂
1. TeSR-E8培养基（干细胞技术，目录号：05990）
2. Vitronectin XF（干细胞技术，目录号：07180）
3. Cell Adhere Dilution Buffer（干细胞技术，目录号：07183）
4. 不含钙和镁的DPBS（1x，DPBS w / o Ca 2 +和Mg 2 +）（HyClone，目录号：SH30028.02）
5. ReLeSR（干细胞技术，目录号：05872）
6. 岩石抑制剂Y-27632（Stem Cell Technologies，目录号：72302）
7. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D5879）
8. DMEM-低葡萄糖（1 g / L）（Gibco，目录号：31885023）
9. 高度合格的胎牛血清（HQ-FBS）（Gibco，目录号：26140079）
10. GultaMAX（100x）（Gibco，目录号：35050061）
11. 非必需氨基酸溶液（NEAA，100x）（Gibco，目录号：11140050）
12. 青霉素 - 链霉素（100x）（Gibco，目录号：15140122）
13. 0.05％胰蛋白酶-EDTA（1x）（Gibco，目录号：25300062）
14. 明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890）
15. 高压灭菌的H 2 O（在我们的实验室中制造）
16. 75％乙醇（体积/体积）（在我们的实验室制造）
17. 异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A416-1）
18. 37％甲醛（vol / vol）（Polysciences，目录号：00625-1）
19. StemPro成骨分化试剂盒（Gibco，目录号：A1007201）
20. StemPro软骨发生分化试剂盒（Gibco，目录号：A1007101）
21. StemPro Adipogenesis Differentiation Kit（Gibco，目录号：A1007001）
22. 茜素红S（Sigma-Aldrich，目录号：A5533）
23. 甲苯胺蓝（Sigma-Aldrich，目录号：89640）
24. Oil Red O解决方案（Sigma-Aldrich，目录号：O1391）
25. 石蜡（Leica Biosystems，目录号：39601095）
26. 用于hiPSC和hESC的完整TeSR-E8培养基（参见食谱）
27. Vitronectin XF涂层培养皿（见食谱）
28. 岩石抑制剂（100x储备溶液，参见食谱）
29. TeSR-E8冷冻介质（见食谱）
30. MSC低葡萄糖培养基（见食谱）
31. 1％（wt / vol）明胶原液（参见食谱）
32. 0.1％明胶涂层容器（见食谱）
33. 2x MSC冷冻培养基（参见食谱）
34. 4％甲醛溶液（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf，目录号：4430000018）
机械掌上单击计数器（Jinnan，型号：JN28-HP）
倒置相位对比显微镜（x4，x10，x20，x40物镜）（奥林巴斯，型号：CKX31）
带多个转子的组织培养离心机（Eppendorf，型号：5401000060）
加湿的CO 2培养箱（Heal Force，型号：HF90）
-80°C冰柜（Thermo Scientific，型号：Forma 900）
液氮罐（Chart Biomedical，型号：YDS-50B-125）
异丙醇细胞冷冻容器（Nalgene，型号：5100-0001）
水浴（上海一恒，型号：HWS-26）
血细胞计数器（Marienfeld，型号：AP-0650030）
真空装置（Sciencetool，型号：BV240）
生物安全柜（苏州安泰空气技术，型号：BSC-1304IIA2）
流式细胞仪（BD Biosciences，型号：LSR Fortessa）
-20°C冰柜（Homa）

软件

流乔（第10版）
Image J（版本1.5.1）

程序

解冻和恢复人类iPSC或人类胚胎干细胞（hiPSCs / hESCs）（6孔板格式）
1. 在50 ml Falcon试管中将所需体积的TeSR-E8培养基预热至室温（见注1）。＆nbsp;
2. 在细胞解冻前至少1小时准备适量的Vitronectin XF包被的6孔板（参见食谱）。
3. 从液氮中快速取出低温小瓶冷冻hiPSC / hESCs，将小瓶浸入37°C水浴中。＆nbsp;
4. 保持盖子不断旋转低温小瓶，不要盖住盖子。＆nbsp;
5. 当大部分细胞解冻/只剩下少量冰晶时，将低温小瓶从水浴中取出，用70％乙醇喷洒低温小瓶，然后将小瓶移入生物安全培养柜中。＆nbsp;
6. 打开盖子，然后将细胞悬浮液轻轻转移到含有之前制备的TeSR-E8培养基的15 ml Falcon试管中（见注2）。
7. 用1 ml TeSR-E8培养基冲洗低温小瓶，将溶液加入相同的Falcon试管中，用移液管轻轻混匀。
8. 在室温下以300 x g 离心5分钟，然后弃去上清液。
9. 用2毫升TeSR-E8培养基重新悬浮hiPSC / hESC颗粒，轻轻上下吹打几次。＆nbsp;
10. 向细胞悬液中加入20μlROCK抑制剂（100x，储备溶液）以增加hPSC的存活率（见注3）。
11. 从预先涂覆的6孔板中丢弃过量的玻连蛋白XF，并将hiPSC / hESC悬浮液缓慢转移到板中。可将一个低温小瓶hiPSC / hESC接种到6孔板的1-2个孔中。
12. 轻轻地来回移动培养板，左右两次运动，使细胞分散到整个孔中（见注4）。
13. 将板置于37℃，5％CO 2培养箱中并培养过夜。
14. 第二天，用不含Rock抑制剂Y-27632的新鲜TeSR-E8培养基更换培养基。
15. 之后，每天在6孔板中每孔用2ml TeSR-E8培养基喂养细胞，使hiPSC / hESC生长4-5天。当细胞达到70％-80％汇合时，它们可以传代（见注5）。
使用ReLeSR（6孔板格式）传代hiPSC和hESC
通常，当在玻连蛋白XF上铺板时，hiPSC和hESC可以作为集落生长，具有典型的未分化，致密和致密的形态和高的细胞核与细胞质比（图1B，第-2天）。理想地，hiPSC和hESC可以每4-5天（70％-80％汇合）传代为单细胞或细胞聚集体。我们经常使用ReLeSR维持hiPSC和hESCs作为细胞聚集体（见注6）。
以下步骤用于在TeSR-E8培养基和玻连蛋白XF系统中从6孔板的孔传代hiPSC / hESC。如果使用其他培养皿，根据表面积调整试剂量（见表1）。

表1.不同培养皿的相关试剂的推荐体积
1. 在开始之前，用Vitronectin XF涂覆新的6孔板至少1小时，并将所需体积的TeSR-E8培养基预热到室温。＆nbsp;
2. 从孔中取出用过的培养基，用2ml DPBS w / o Ca 2 +和Mg 2 +洗涤细胞一次。无需去除hiPSC / hESC的分化区域。
3. 除去没有Ca 2 +和Mg 2 +的DPBS，然后在6孔板的每个孔中加入1ml ReLeSR。旋转平板以在整个细胞表面分布ReLeSR，然后在1分钟内吸出ReLeSR。＆nbsp;
4. 在室温下孵育hiPSCs / hESCs 5分钟（见注7），并在倒置相差显微镜下检查细胞解离。＆nbsp;
5. 当hiPSC / hESC开始在边缘分离并向上取圆时，它们可以从孔中取出，然后在6孔板的每个孔中加入1ml TeSR-E8培养基。
6. 通过轻轻地将混合物上下移液5-6次，将大菌落分散成小块。将所有细胞聚集体收集到15ml管中（见注8）。
7. 用另外1ml TeSR-E8培养基冲洗孔并转移到相同的15ml管中。
8. 从预涂板上除去残留的Vitronectin XF溶液。并将细胞聚集体以所需密度均匀地分成板。我们通常以1：6的比例分割hiPSC / hESC（见注9）。＆nbsp;
9. 每孔补充适量的TeSR-E8培养基，使每孔最终含有2ml TeSR-E8培养基。＆nbsp;
10. 在培养系统中加入20μlRock抑制剂Y-27632（100x，工作浓度10μM），以提高hiPSCs / hESCs的存活率。＆nbsp;
11. 轻轻地快速移动平板几次，前后左右移动，使细胞聚集体均匀分布在平板表面，然后将平板放回37°C培养箱（见注10）。＆nbsp;
12. 每天刷新TeSR-E8培养基并观察培养物以监测生长状况，直至下次传代或银行（见注11）。＆nbsp;
使用单步中等开关从hiPSC和hESC中获得MSC 我们使用简单有效的方案将hiPSC和hESCs分化为无饲养层培养系统中的MSC。该区分程序的时间表图如图1A所示。
1. 第2天：在6孔板中制备hiPSC和hESC
  在hiPSCs / hESCs分化成MSC之前，通过在TeSR-E8培养基中的ReLeSR处理将hiPSC / hESC作为团块铺板到玻连蛋白XF包被的6孔板中（图1B，第-2天）。
  1. 预热TeSR-E8介质。同时，如前所述制备玻连蛋白XF包被的6孔板。
  2. 将hiPSC / hESC的种子细胞团块以所需密度进入玻连蛋白XF包被的6孔板中，作为方法B中的步骤B2-B11。＆nbsp;
  3. 在37℃下培养细胞过夜以最大限度地使细胞附着孔。
2. 第-1天：新鲜的TeSR-E8介质更新
  1. 在显微镜下检查细胞生长情况，以确保大多数传代的hiPSC / hESC聚集体附着在新的孔上并开始增殖。＆nbsp;
  2. 在6孔板中用2ml新鲜的TeSR-E8培养基除去用过的培养基和饲养细胞，并继续在37℃，5％CO 2下孵育细胞。
  3. 监测细胞生长，直到hiPSCs / hESC成为MSC分化的至少40％-50％汇合。＆nbsp;
3. 第0天： MSC低葡萄糖培养基开关
  在开始分化之前，hiPSC / hESC通常应达到至少40％-50％的汇合（见注12）。 hiPSC / hESC菌落显示典型的紧凑形态，边界清晰，由紧密堆积的细胞组成（图1B，第0天）。＆nbsp;
  1. 在37°C水浴中预热MSC低葡萄糖培养基。＆nbsp;
  2. 当传代的hiPSC / hESC在6孔板中达到所需的汇合时，轻轻除去用过的TeSR-E8培养基，然后用2ml MSC低葡萄糖培养基洗涤hiPSC / hESC菌落两次。＆nbsp;
  3. 彻底吸出用过的MSC低葡萄糖培养基，在6孔板的每个孔中加入2ml新鲜的MSC低葡萄糖培养基加入hiPSCs / hESCs中。＆nbsp;
  4. 此后，每隔一天刷新MSC低葡萄糖培养基。＆nbsp;
4. 第2-13天：新鲜MSC低葡萄糖培养基更新
  在MSC低葡萄糖培养基处理后的前2天，由于来自MSC低葡萄糖培养基中的分化的培养压力，许多细胞死亡。每隔一天用新鲜的MSC低葡萄糖培养基喂养细胞。
  1. 轻轻吸出用过的MSC低葡萄糖培养基和死细胞。＆nbsp;
  2. 用DPBS w / o Ca 2 +和Mg 2 +洗涤分化细胞两次，将2ml新鲜MSC低葡萄糖培养基加入培养孔中并继续培养37℃的细胞。 °C，5％CO 2（见注13）。
  3. 在显微镜下观察细胞以检查细胞形态变化并记录照片（见注释14）（图1B，第7天）。
5. 第14天：将异质细胞衍生物涂在0.1％明胶包被的T25烧瓶上
  在这个时间点，细胞衍生是汇合的，但是具有异质细胞群（图1B，第14天）。细胞衍生物可以传代到0.1％明胶涂层烧瓶上。
  1. 将0.05％胰蛋白酶-EDTA和MSC低葡萄糖培养基预热至室温，并在37℃培养箱中用0.1％明胶预涂T25烧瓶。
  2. 从6孔板中吸出用过的MSC低葡萄糖培养基。
  3. 用1 ml DPBS w / o Ca 2 +和Mg 2 +洗涤细胞一次，然后丢弃。＆nbsp;
  4. 向6孔板的孔中加入1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA。旋转板以确保胰蛋白酶溶液完全覆盖整个细胞表面。＆nbsp;
  5. 将细胞衍生物在37°C孵育5分钟（见注释15）。如有必要，轻轻敲打板以移除细胞。
  6. 向孔中加入2ml MSC低葡萄糖培养基以中和胰蛋白酶消化。然后上下移液细胞数次（通常8-10次），将细胞衍生物分解成单个细胞。＆nbsp;
  7. 将细胞悬浮液收集到15ml Falcon管中，用另外的2ml MSC低葡萄糖培养基洗涤培养孔，并将所有细胞悬浮液汇集到相同的15ml Falcon管中。＆nbsp;
  8. 将细胞悬浮液在300 x g 离心5分钟，然后弃去上清液。＆nbsp;
  9. 用手指敲打破碎细胞沉淀，然后用3ml MSC低葡萄糖培养基轻轻重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液。＆nbsp;
  10. 将所有细胞悬浮液加入预先制备的0.1％明胶包被的T25烧瓶中。＆nbsp;
  11. 将额外的培养基补充到T25烧瓶中，确保T25烧瓶中至少含有5 ml培养基。＆nbsp;
  12. 在37℃，5％CO 2培养箱中培养细胞，每隔一天更新MSC低葡萄糖培养基，直至细胞达到80％汇合。＆nbsp;
6. 第15-20天：新鲜MSC低葡萄糖培养基更新
  在将细胞衍生物涂布到0.1％明胶包被的烧瓶中后的前2天，并非所有细胞都可以附着烧瓶。附着的细胞是我们需要的预期细胞。在5-7天内，附着的细胞可以在T25烧瓶中融合。 MSC低葡萄糖培养基每隔一天更新一次。＆nbsp;
7. 第21-29天：通过连续胰蛋白酶消化（8天）丰富hiPSC-MSCs和hESC-MSCs
  当T25烧瓶中的分化细胞达到80％-90％汇合时，可将它们分成新的T25烧瓶。大多数细胞呈现成纤维细胞样形态（纺锤形）（图1B，第21天）。
  1. 如前所述制备0.1％明胶包被的T25烧瓶，温热MSC低葡萄糖培养基和0.05％胰蛋白酶-EDTA。
  2. 如步骤C5b-C5h中那样收获细胞沉淀。＆nbsp;
  3. 用手指敲打以破碎细胞沉淀，并将细胞重悬于4ml MSC低葡萄糖培养基中以制备单细胞悬液。＆nbsp;
  4. 使用血细胞计数器计数总细胞数，并使用MSC低葡萄糖培养基将细胞密度调节至2.5×10 5细胞/ ml。
  5. 将细胞接种到新的0.1％明胶包被的T25烧瓶中，细胞密度为1×10 4细胞/ cm 2（即，2.5在T25烧瓶中×10 5细胞（参见注释16）。同时，我们将此代细胞指定为第0代（P0），并将细胞命名为hiPSC-MSC / hESC-MSC。
  6. 将额外的MSC低葡萄糖培养基补充到T25烧瓶中，确保T25烧瓶含有5 ml MSC低葡萄糖培养基。＆nbsp;
  7. 此后，每隔一天更换MSC低葡萄糖培养基。
  8. 当胰蛋白酶消化80％-90％汇合时（通常在4-5天内），通过胰蛋白酶消化连续传代hiPSC-MSC / hESC-MSC。衍生的MSCs可以逐渐成为成熟的群体，传代次数增加2倍。将相应的代指定为P1，P2。（图1B，MSC，P2）。大规模扩展这些hiPSC-MSC / hESC-MSC用于银行业务，特征化和后期实验。＆nbsp;
图1.在无饲养细胞系统中通过一步推导将hiPSC和hESC分化为MSC。：一种。通过MSC低葡萄糖培养基处理和在无饲养细胞培养系统中用胰蛋白酶消化连续传代有效区分hiPSC和hESC进入MSC的示意图。 B.在第-2,0,7,14和21天从hiPSC和hESC MSC衍生期间关键噬菌体的细胞的代表性形态，以及成熟hiPSC-MSC和hESC-MSC的P2。 P2，通道2.比例尺：100μm。＆nbsp;
低温保存hiPSC-MSCs和hESC-MSCs
连续胰蛋白酶消化后，hiPSC-MSC / hESC-MSC可以变得更成熟。因此，它们可以在第2代后冷冻保存。＆nbsp;
1. 准备新鲜的2x MSC冷冻培养基，并将其置于冰上直至使用。＆nbsp;
2. 按照步骤C5b-C5h制作MSC颗粒。
3. 通过手指敲击移出细胞沉淀，并将细胞重悬于MSC低葡萄糖培养基中以制备单细胞悬液。＆nbsp;
4. 使用血细胞计数器计数总细胞数，并将细胞密度调节至2×10 6细胞/ ml。＆nbsp;
5. 将相同体积的冷2x MSC冷冻培养基加入MSC细胞悬浮液中，并彻底混合。
6. 将1ml细胞混合物等分到每个低温小瓶中。每个低温小瓶含有1×10 6个 6细胞（见注17）。
7. 将低温小瓶快速放入冷冻容器中，并在-80°C保持过夜。＆nbsp;
8. 第二天，将带有细胞的低温小瓶转移到-180°C冰箱或液氮罐中进行长期储存。＆nbsp;
通过流式细胞术分析MSC表面抗原
hiPSC-MSC / hESC-MSC表达与hBM-MSC相似的表面抗原。抗人抗原CD34，CD45，CD73，CD90和CD105的抗体可用于该测定（参见抗体）。在该测定中，hBM-MSC可用作阳性对照细胞。阴性标记：CD34 -，CD45 -;阳性标记：CD73 +，CD90 +和CD105 +。
在hiPSC-MSC，hESC-MSC和hBM-MSC中MSC表面抗原分析的结果如图2所示。
1. 收集MSC颗粒作为步骤C5b-C5h。
2. 通过手指敲打破碎细胞沉淀，并用冷的1％FBS在DPBS中重悬细胞，其中Ca 2+和Mg 2 +。
3. 使用血细胞计数器计数总细胞数，并将细胞密度调节至2×10 6 sup细胞/ ml。
4. 将2×10 5细胞（100μl细胞悬浮液）转移到1.5 ml离心管中（见注18）。＆nbsp;
5. 将相应量的MSC抗体（参见抗体）添加到每个试管中，并通过移液轻轻混合。＆nbsp;
6. 在室温下避光孵育30分钟。＆nbsp;
7. 用含有1％FBS的DPBS（Ca 2+）和Mg 2 +洗涤细胞一次，最后将细胞样品重悬于250μl4％甲醛-DPBS中，不含Ca 2 +和Mg 2 +。＆nbsp;
8. 用流式细胞仪（LSR Fortessa）分析样品（见注19）。
图2.在hiPSC-ESC，hESC-MSC和hBM-MSC中MSC表面抗原的流式细胞术分析。在hiPSC-MSC（h），hESC-MSC中分析MSC表面抗原的表达百分比（ B）和hBM-MSC（C）。未染色的细胞用作对照。通过对未染色的细胞进行标准化来计算每种标记物阳性细胞的百分比。阴性标记：CD34 -，CD45 -;阳性标记：CD73 +，CD90 +和CD105 +。＆nbsp;
通过体外多能分化鉴定hiPSC-MSCs和hESC-MSCs
hiPSC-MSC和hESC-MSC具有多潜能分化潜能（成骨，软骨形成和脂肪生成）。我们建议通常使用细胞的早期传代（第5代）进行体外分化试验，以表征hiPSC-MSCs和hESC-MSC的多能性（见注释20）（图3）。 />
1. hiPSC-MSCs和hESC-MSCs的成骨分化注意：可以使用StemPro成骨分化试剂盒进行成骨分化。
  1. 当hiPSC-MSC和hESC-MSC在T75烧瓶中达到80％汇合时，用DPBS w / o Ca 2 +和Mg 2 +洗涤细胞。＆nbsp;
  2. 用0.05％胰蛋白酶-EDTA收获细胞。
  3. 计数细胞并将细胞悬浮液接种到0.1％明胶包被的24孔板中，细胞密度为1×10 4细胞/ cm 2，0.5 ml MSC低葡萄糖培养基（即，2×10 4细胞/孔在24孔板中）。＆nbsp;
  4. 将细胞在37℃，5％CO 2培养箱中在MSC低葡萄糖培养基中孵育3天。＆nbsp;
  5. 用DPBS w / o Ca 2 +和Mg 2 +洗涤细胞一次，然后加入0.5ml成骨分化培养基。
  6. 用成骨分化培养基每3天喂养培养物至3周。
  7. 分化培养21天后，用4％甲醛固定细胞30分钟。＆nbsp;
  8. 用2％茜素红S染色细胞用于钙沉积物鉴定（图3A），然后使用标准光学显微镜获取图像。＆nbsp;
2. hiPSC-MSCs和hESC-MSCs的软骨分化
  注意：可以使用StemPro软骨细胞分化试剂盒进行软骨形成分化。
  1. 在分化当天，hiPSC-MSC和hESC-MSC应该80％汇合。＆nbsp;
  2. 吸出MSC低葡萄糖培养基，用DPBS w / o Ca 2 +和Mg 2 +冲洗细胞，并用0.05％胰蛋白酶-EDTA收集细胞。＆nbsp;
  3. 计数细胞并用MSC低葡萄糖培养基将hiPSC-MSC / hESC-MSC调节至细胞密度为1.6×10×10×/ ml细胞/ ml。＆nbsp;
  4. 在96孔多孔板的中心仅培养5μlhitPSC-MSC / hESC-MSC溶液（8×10 4细胞/孔）。＆nbsp;
  5. 将板放回37℃，5％CO 2培养箱中2小时微量培养。
  6. 微团种培养后，将100μl软骨生成培养基补充到培养孔中。＆nbsp;
  7. 将细胞在37℃，5％CO 2培养箱中孵育3周，并用软骨形成分化培养基每3天喂养培养物。
  8. 石蜡通过甲苯胺蓝染色嵌入软骨形成的颗粒，切片和染料细胞以评估细胞外软骨细胞基质（图3B），然后使用标准光学显微镜获取图像。
3. hiPSC-MSCs和hESC-MSCs的成脂分化
  注意：可以使用StemPro Adipogenesis Differentiation Kit进行脂肪形成分化。
  1. 在显微镜下观察细胞以确保hiPSC-MSC和hESC-MSC在分化前达到80％汇合。＆nbsp;
  2. 通过用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理将细胞解离成单细胞悬浮液。
  3. 计数细胞并将细胞悬浮液接种到0.1％明胶包被的24孔板中，密度为1×10 4细胞/ cm 2 0.5ml预热MSC低葡萄糖培养基（即，2×10 4细胞/孔在24孔板中）。＆nbsp;
  4. 将细胞在MSC低糖培养基中在37℃，5％CO 2培养箱中孵育3天。＆nbsp;
  5. 用DPBS w / o Ca 2 +和Mg 2 +洗涤细胞一次，然后加入500μl脂肪形成分化培养基。＆nbsp;
  6. 每3天更换培养基，并用脂肪形成分化培养基连续培养细胞2周。＆nbsp;
  7. 诱导培养14天后，用4％甲醛固定细胞30分钟。＆nbsp;
  8. 应用油红O染色以验证脂滴（图3C），然后使用标准光学显微镜获取图像。
图3. hiPSC-MSCs和hESC-MSC的三系分化。 A.茜素红染色hiPSC-MSCs和hESC-MSCs在成骨分化培养基中钙沉积3周。放大倍数：50倍。 B.在软骨形成分化培养基中3周后，hiPSC-MSC和hESC-MSC的软骨细胞外基质的甲苯胺蓝染色。放大倍数：100倍。 C.脂肪形成分化培养基中hiPSC-MSC和hESC-MSC的脂滴的油红O染色2周。放大倍数：50倍。

数据分析

当使用针对CD34，CD45，CD73，CD90和CD105的抗体分析MSC表面抗原表征时，在BD Fortessa流式细胞仪上记录至少20,000个事件。 Flow Jo软件用于分析流式细胞仪数据。
可以使用ImageJ软件分析骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞的染色照片。

笔记

不要在37°C水浴中加热TeSR-E8介质。
将hiPSCs / hESCs以逐滴方式转移到Falcon管中，同时轻轻地来回移动Falcon管以混合hPSC，这可以减少对hPSC的渗透冲击并确保细胞活力。＆nbsp;
向hPSC培养基中加入Rock抑制剂Y-27632（100x储备溶液）24小时，大大提高了解冻后hPSC的平板效率和活力，而不影响其多能性。
轻轻移动培养皿，不要旋转它们，因为它会将所有细胞带到培养皿的中心。
hiPSC / hESC菌落应在解冻后2天内变得可见，并且在4-5天内，hiPSC / hESC应准备好传代。
诸如胶原酶IV或分散酶的酶对于在TeSR-E8培养基系统中培养的hPSC不能很好地起作用。 ReLeSR是一种无酶试剂，适用于将hiPSCs和hESCs解离成细胞团块进行常规传代，无需人工去除分化区域。＆nbsp;
ReLeSR的治疗时间可根据hPSC细胞系和集落质量而变化。对于某些某些hPSC细胞系，ReLeSR的最佳解离时间可能需要超过5分钟。
在ReLeSR处理后，轻轻地移液细胞悬浮液数次可以将hPSC集落破碎成小细胞团块。同时，避免产生单细胞悬液。有时在ReLeSR治疗后有些细胞不会分离。收集它们是不必要的。＆nbsp;
对于不同的hPSC系，分流比可以变化。建立的hPSC培养物可以以1：6至1:12的比例分开（即，来自一个孔的细胞团块可以接种到6到12个孔中）。＆nbsp;
细胞萎缩的不均匀分布可以增加hiPSC / hESC的分化。避免干扰板过夜以最大限度地附着细胞。
传代后第二天看到一些细胞碎片是正常的。当hiPSC / hESC达到80％汇合时，可以用TeSR-E8冷冻培养基传代或冷冻它们。不要让hiPSC / hESC过度融合以避免自发分化。
接种后2天，hiPSC / hESC应至少融合40％。如果细胞不足以初始化分化，则可以在MSC分化之前将细胞孵育1或2天。然而，在MSC分化之前，hiPSC / hESC不应过度融合。否则，他们将经历随机分化。＆nbsp;
在hiPSC / hESC分化为MSCs的前几天，分化细胞应该用DPBS w / o Ca 2 +和Mg 2 +洗涤，因为更新培养基许多死细胞。之后，如果用过的介质是干净的并且没有多少死细胞，则不需要洗涤细胞的步骤。＆nbsp;
早在从紧密和扁平的菌落分化成成纤维细胞样细胞后7天，细胞形态变化可以逐渐显现。在该分化过程中来自hiPSC和hESC的大多数细胞在第14天将呈现典型的纺锤形形态。＆nbsp;
在显微镜下观察细胞单层是很重要的。当大多数细胞在边缘从培养皿表面脱离时，它们就可以被移除了。某些细胞系的孵育时间可能少于5分钟。＆nbsp;
细胞密度为1×10 5 4细胞/ cm 2对于来源于hiPSC / hESC的MSC的细胞生长是良好的密度。在这个时间点，我们也可以直接将细胞以1：3-1：4的比例分成新的T25烧瓶。
通常，T75烧瓶中的hiPSC-MSC / hESC-MSC可以在80％汇合时冷冻成4-6个低温小瓶。＆nbsp;
请记住为未染色的控制准备小组。＆nbsp;
我们建议在同一天分析样品以获得最佳结果。如果样品不能在同一天进行分析，样品可以在4°C的黑暗中保存数天，直至分析。＆nbsp;
通常，hiPSC-MSCs和hESC-MSCs在晚期传代数（第15代后）将逐渐丧失其多重性。

食谱

用于hiPSC和hESC的完整TeSR-E8培养基
1. 在室温（15-25°C）或4°C过夜解冻TeSR-E8补充剂（25x）。不要在37°C下解冻。彻底混合。解冻后立即使用补充剂，不要重新冷冻
2. 准备500毫升完全TeSR-E8培养基，无菌混合480毫升TeSR-E8基础培养基和20毫升TeSR-E8补充剂（25倍）
3. 完整的TeSR-E8培养基可在4°C下储存长达2周。或者，将50 ml Complete TeSR-E8培养基等分，并在-20°C下储存长达6个月
4. 使用前，在室温下加热完整的TeSR-E8培养基。不要在37°C水浴中加热介质
玻连蛋白XF涂层培养皿（6孔板格式为例）
1. 在室温下解冻小瓶的Vitronectin XF。如果不立即使用，等分Vitronectin XF并立即在-80°C冷冻。避免反复冻融循环。 Vitronectin XF可在-80°C下储存长达数月
2. 为了制备工作溶液，在细胞粘附稀释缓冲液中以1:25的比例稀释玻连蛋白XF，使最终工作浓度达到10μg/ ml（即，每1 ml使用40μl玻连蛋白XF细胞粘附稀释缓冲液）
3. 将240μl解冻的Vitronectin XF加入含有6 ml Cell Adhere Dilution Buffer的15 ml Falcon试管中。通过移液轻轻地上下混合溶液。不要涡旋
4. 立即使用1 ml稀释的Vitronectin XF溶液涂覆6孔板的每个孔（参见表1 ，了解不同培养皿的推荐涂层体积）
5. 轻轻旋转培养板，涂抹玻连蛋白XF溶液，均匀覆盖培养板的整个表面
6. 将Vitronectin XF包被的板在室温下孵育至少1小时。如果不立即使用，可以用封口膜密封培养板，并在4℃下储存一周。使用前，将储存的培养板加热至室温至少30分钟
7. 在铺板细胞之前，从培养板上除去多余的Vitronectin XF溶液。
8. 立即将hiPSC或hESC接种到Vitronectin XF包被的培养板上，使用适当体积的Complete TeSR-E8培养基（2 ml培养基用于一个6孔板，参见表1 ）
岩石抑制剂（100x库存溶液）
ROCK抑制剂Y-27632是ROCK途径的细胞渗透性，高选择性抑制剂。 Y-27632对光线敏感。因此，应该保护它免受光照。
1. 将1 mg Y-27632溶于3.12 ml冷却的蒸馏水中，制备100x储备液（1 mM）
2. 将储备溶液分成100μl等分试样并在-20°C下储存长达6个月。 Y-27632在10μM的最终工作浓度下有效
TeSR-E8冷冻介质
1. 为制备10ml新鲜的TeSR-E8冷冻培养基，在15ml Falcon管（培养基：DMSO = 9：1）中无菌混合9ml Complete TeSR-E8培养基和1ml DMSO。
2. 将TeSR-E8冷冻介质存放在冰上直至使用。使用后丢弃任何残留的冷冻介质。
MSC低葡萄糖培养基
MSC低葡萄糖培养基含有DMEM-低葡萄糖（1 g / L），补充10％HQ-FBS，1％青霉素 - 链霉素，1％NEAA和1％GlutaMAX。
1. 制备500 ml MSC低葡萄糖培养基，混合50 ml HQ-FBS，5 ml青霉素 - 链霉素，5 ml NEAA和5 ml GlutaMAX，然后用DMEM-低葡萄糖培养基填充至500 ml
2. 将MSC低葡萄糖培养基在4°C下保存长达2个月
1％（wt / vol）明胶原液
明胶原液含有1％（wt / vol）明胶，蒸馏水H 2。
1. 称取10g明胶粉末，并将其加入1,000ml蒸馏水中，加入H 2 O＆lt; O＆gt;
2. 加热并在热板上搅拌明胶溶液直至明胶粉末完全溶解。
3. 将明胶原液在115℃高压灭菌15分钟，制成均匀溶液（1％储备溶液）＆nbsp;
4. 将明胶原液分配到500毫升瓶中，在室温下储存1％明胶溶液至几个月。
0.1％明胶涂层容器（以T25烧瓶形式为例）
1. 用蒸馏水（10倍稀释）将1％明胶原液稀释成0.1％明胶工作液
2. 加入至少5毫升0.1％明胶工作溶液，覆盖T25烧瓶的整个底部。
3. 将T25烧瓶在37℃孵育1小时。如果不立即使用，涂层容器可以在4°C下储存数周。
4. 去除多余的明胶溶液，然后将细胞悬浮液直接接种到0.1％明胶包被的T25烧瓶上。
2x MSC冷冻培养基
我们使用2x MSC冷冻培养基冷冻保存MSC。 2x MSC冷冻培养基含有80％HQ-FBS和20％DMSO。
1. 制备10 ml 2x MSC冷冻培养基，在15 ml Falcon试管中无菌混合8 ml HQ-FBS和2 ml DMSO
2. 使用前在冰上用2x MSC冷冻介质冷却Falcon管＆nbsp;
3. 使用时，将2x MSC冷冻培养基与细胞悬液以1：1的比例混合。使用后，请始终制作新鲜的冷冻介质并丢弃任何残留的冷冻介质
4. 最终培养基大约含有50％MSC低葡萄糖培养基，40％HQ-FBS和10％DMSO＆nbsp;
4％甲醛溶液
该甲醛溶液含有37％甲醛和DPBS，比例为4:34。甲醛是一种危险的试剂，因此在处理时应戴上手套和实验室外套。
1. 为了制备37毫升4％甲醛溶液，将4毫升37％甲醛加到33毫升不含Ca 2+的DPBS中，并加入Mg 2+＆nbsp;
2. 彻底混合溶液，使用前保持在4°C。使用前务必准备新鲜的4％甲醛溶液

致谢

该协议是根据我们之前在科学报告（Zou et al。，2013）和干细胞研究与治疗（Kang et al。，2015）中发表的研究开发和修改的。。这项工作得到了深圳市科技创新委员会（CKCY2016082917391652，CKCY2016082917372416和JCYJ20160226192924528）的支持。我们也感谢奥胡斯大学的FACS核心设施。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

参考

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