材料和试剂

提示
0.1-10μl（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：02-681-440）
1-200μl（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：02-707-502）
101-1,000μl（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：02-707-509）
0.01-1 ml注射器（Onnifix R -F，目录号：9161406V）
Falcon® 50 ml试管（BD Biosciences，Falcon®，目录号：352098）
Falcon® 15 ml试管（BD Biosciences，Falcon®，目录号：352096）
40μm尼龙网格过滤器（Corning，目录号：352350）
70μm尼龙细胞过滤器（Falcon，BD Biosciences）
150厘米^{2烧瓶（TPP Techno Plastic Products，目录号：93150）}
75 cm 2组织培养瓶（Corning，Falcon®，目录号：353110）
6孔组织培养板（Corning，Falcon®，目录号：353224）
5毫升圆底聚苯乙烯试管（Corning，Falcon®，目录号：352052）
雌性C57BL / 6小鼠（Janvier，法国）
在C57BL / 6 CD45.2背景上的Thy1.1 + Pmel-1 T细胞受体（TCR）转基因小鼠（Jackson Laboratory）
hgp100 25-33（KVPRNQDWL）（ANASPEC，目录号：AS-62589）
无菌DPBS，1x（Life Technologies，Gibco，目录号：14190-094）
细胞痕量紫染料（BV）（Life Technologies，目录号：65-0842-85）
IL-2（50 IU / ml; PeproTech）
RPMI 1640培养基，GlutaMAX TM（Sigma-Aldrich，目录号：R8758-500）
台盼蓝（Gibco，目录号：15250061）
HBSS（Bioconcept，目录号：3-02K32-I）
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）（Life Technologies，目录号：C34554）
100x青霉素/链霉素（Mediatech，目录号：30-002-Cl）＆nbsp;
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：12133C）
PBS
HEPES（Gibco，目录号：15630056）
RBC裂解缓冲液（自制）（一体积的Tris碱200mM pH 7.5和九体积的NH 4 Cl 150mM）＆nbsp;
DMEM（Gibco，目录号：12634010）
完整的RPMI-1640培养基（参见食谱）
FACS缓冲液（见食谱）

设备

细胞计数材料（自动细胞计数器或手动计数器）＆nbsp;
Pipetman® L（Gilson）
解剖套件（含剪刀，弯曲钳）
血球
离心分离机
MyBath TM水浴（Benchmark Scientific）
培养箱37℃，5％CO 2
流式细胞仪Galios（Beckman Coulter），ARIA FACS分选仪（BD Bioscience）

软件

FlowJo_V10
用于PC的GraphPad Prism软件，版本7.03，用于数据分析

程序

启动和生成CTL Pmel-CD8细胞体外（Benkhoucha et al。，2013）
1. 对于大量培养，从8至10周龄未免疫的Pmel-1转基因小鼠的一个或一组脾脏制备单细胞悬浮液*。
  注意：* C57BL / 6 CD45.2上的Thy1.1 + Pmel-1 T细胞受体（TCR）转基因小鼠背景，其TCR识别对应于鼠和人gp100的氨基酸25-33的H2D b 限制性表位（hgp100 <子> 25-33 ）。
2. 轻轻匀浆脾脏并通过70μm尼龙细胞过滤器（Falcon，BD Biosciences）。
3. 在室温下用ACK裂解缓冲液（BioWhittaker）裂解红细胞5分钟。
4. 从一个脾中计数单核细胞并以5×10 6个细胞/ ml悬浮于培养基（DMEM）中，然后将细胞暴露于10μg/ ml人gp100 25-33肽（KVPRNQDWL）在37℃下保持1小时。
5. 用DMEM洗涤三次后，在150cm 2细胞培养瓶中培养单核细胞群（20ml培养基）。在第2天和第4天将IL-2（50IU / ml; PeproTech）加入培养物中。
6. 在第5天，从培养板收集细胞，用培养基以1,200rpm洗涤5分钟，然后进行功能性（体外杀伤测定，此处未显示）和表型测定（参见图1，细胞内FACS染色）：IFNγ，颗粒酶B，穿孔素，FasL）。培养5天后，超过98％的大量细胞是CD3 + CD8 + T细胞。
  
  图1.第5天分化的Pmel-1 CD3 + <颗粒酶B，穿孔素，IFN-γ和FasL的代表性图（直方图） strong> CD8 + T细胞
7. 一旦我们检查了CTL的表型，就会将它们静脉注射到受体小鼠（10 6细胞/小鼠）（见图2）。
  
  图2.细胞毒性杀伤试验的代表性程序体内
在无菌细胞培养条件下靶细胞制备
注意：此步骤用于制备肽脉冲的靶细胞，并用CFSE或BV对其进行染色，以区分肽脉冲的靶细胞和对照靶细胞。
1. gp100 25-33靶细胞的肽加载
  1. 在RBC裂解缓冲液中于37℃裂解10×上皮细胞（来自CD45.1 C57BL6 / J小鼠）3分钟，然后用PBS洗涤两次。
  2. 在RPMI-1640完全培养基中重悬细胞。
  3. 使用血细胞计数器通过台盼蓝排除计数单核细胞。
  4. 以5×10 6 sup / ml / ml RPMI-1640完全培养基重悬细胞。
  5. 将细胞均分为两个单独的50ml Falcon管 - 一个用于肽脉冲的靶细胞（将用CFSE染色），另一个用于未脉冲的靶细胞（将用亮紫色染色）。
  6. 以1μg/ ml添加至细胞的一部分（肽脉冲的）gp100 25-33肽。
  7. 向未脉冲的靶细胞中加入等量的PBS。
  8. 将细胞在37℃水浴（或37℃，5％CO 2的培养箱中）孵育1小时。
  9. 用RPMI-1640完全培养基洗涤细胞两次。
  10. 将细胞在300℃下离心5分钟，在4℃下离心5分钟。
  11. 将细胞沉淀重悬于HBSS中。
2. 在无菌条件下CFSE标记肽脉冲的靶细胞
  1. 使用血细胞计数器通过台盼蓝排除计数所有活细胞。
  2. 将细胞重悬于HBSS中，浓度为5×10 5 /μl/ ml。
  3. 解冻等份的5mM储备CFSE溶液。
  4. 用CFSE孵育脉冲靶脾细胞：每毫升脉冲靶细胞加入1μl5mM原液CFSE（终浓度5μM）。
  5. 上下移取细胞以充分混合并在37℃的水浴中孵育10分钟。定期轻轻搅动细胞。
  6. 将10倍体积的预热的RPMI-1640完全培养基加入到CFSE标记的细胞中以停止反应。
  7. 在4℃下在300 x g 下沉淀细胞5分钟。
  8. 除去上清液，将沉淀重悬于冷的RPMI-1640完全培养基中。
  9. 用冷RPMI-1640完全培养基再洗涤细胞两次。
  10. 使用血细胞计数器通过台盼蓝排除计数单核细胞。
  11. 用冷PBS洗涤细胞。
  12. 将细胞群重悬于PBS中5×10 6 sup / ml。
3. BV在无菌条件下标记未脉冲的靶细胞
  1. 使用血细胞计数器通过台盼蓝排除计数所有活细胞。
  2. 将细胞重悬于HBSS中，浓度为5×10 5 /μl/ ml。
  3. 解冻等份的5mM原液BV（cellTrace TM）溶液。
  4. 用BV孵育未脉冲的靶脾细胞：每毫升未脉冲的靶细胞加入1μl的5mM原液BV（终浓度为5μM）。
  5. 上下移取细胞以充分混合并在室温下孵育20分钟（避光）。定期轻轻搅动细胞。
  6. 将预热的RPMI-1640完全培养基体积加入BV标记的细胞中10倍以停止反应。
  7. 在4℃下在300 x g 下沉淀细胞5分钟。
  8. 除去上清液，将沉淀重悬于冷的RPMI-1640完全培养基中。
  9. 用冷RPMI-1640完全培养基再洗涤细胞两次。
  10. 使用血细胞计数器通过台盼蓝排除计数单核细胞。
  11. 用冷PBS洗涤细胞。
  12. 将细胞群重悬于PBS中5×10 6 sup / ml。
4. 在CTL注射到三只小鼠后5小时，将等体积（〜相等数量）的肽脉冲的CFSE细胞与未脉冲的BV细胞组合，并进行静脉内注射。在受体小鼠中注射（10 5细胞/小鼠）。
  注意：在4°C时将混合物中的50,000个细胞保留用于流式细胞分析（输入比率）（图3A）。
  
  图3. 体内杀灭试验的FACS分析的代表性点图。 A.点图CFSE对比输入的BV（肽脉冲的CFSE标记的和BV标记的非脉冲CD45.1靶细胞的1：1混合物）。 B.点图显示CD45.1（靶细胞供体小鼠）CD45.2（靶细胞受体小鼠的）CD45.2（未接受CTL的CD45.2受体小鼠的脾细胞）的侧向散射（SSC）。（对照）小鼠或已接受CTL（测试组）。 C.点图CFSE对比BV显示来自对照CD45.2小鼠的脾脏中靶细胞群的百分比。 D.点图CFSE对比BV显示来自测试CD45.2小鼠的脾中靶细胞群的百分比。
转移后24小时用于流式细胞术分析的脾细胞的制备
注意：此步骤通过CFSE和亮紫色细胞群的流式细胞术分析来分析脾脏中的抗原特异性杀伤能力。
1. 从两组中收集受体小鼠，对照组与CTL注射小鼠。如方法A中那样分离脾脏，其中裂解均质化的红细胞并制备脾细胞。
2. 在RPMI-1640完全培养基中重悬细胞。
3. 使用血细胞计数器通过台盼蓝排除计数单核细胞。
4. 用脾样品进行流式细胞术分析（图3）。

数据分析

为了分析获得后的FACS数据，通过使用以下门控策略来区分2个群体（CFSE和BV）：在FSC和SSC上定义脾细胞门，然后在排除双峰后，在CD45.1上门。在CD45.1 +细胞内，在CFSE（FL1）和BV（FL9）上进行门控，并确定（i）CFSE的百分比和（ii）BV细胞的百分比。
为了计算特定裂解的百分比，对于每只小鼠或样品使用以下等式，与一只对照'天真'未注射的小鼠相比：

在图3中：输入比率= 0.82
对照小鼠的％裂解= 1 - [0.82×（50.6 / 45.7）]×100 = 9.2％注射CTL的小鼠裂解率= 1 - [0.82 x（30.1 / 66）]×100 = 62.6％

笔记

当用BV染色用hgp100肽脉冲的靶细胞时，获得了类似的结果，并且用CFSE染色未用任何肽脉冲的靶细胞。

食谱

完成RPMI-1640培养基
10％FBS
1％青霉素/链霉素与L-谷氨酰胺
1％HEPES＆nbsp;
FACS缓冲区
PBS
1％BSA

致谢

这项工作得到了P.H.L的资助。来自瑞士国家科学基金会（No. 310030_153164）和SMSS。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益

伦理

所有小鼠均为8-10周龄。将动物饲养在医学院（瑞士日内瓦）的大学医学中心的无特定病原体的屏障设施中。所有实验方案和程序均由日内瓦大学医学院的机构动物护理和使用委员会审查和批准。动物护理和实验程序按照日内瓦大学医学院动物护理和使用委员会的指导方针进行。

参考

Benkhoucha，M.，Molnarfi，N.，Schneiter，G.，Walker，P。R.和Lalive，P。H.（2013）。神经营养性肝细胞生长因子减弱CD8 +细胞毒性T淋巴细胞活性。 J Neuroinflammation 10：154。
Rosenberg，S。A.（2001）。人类肿瘤免疫学和免疫疗法的进展。自然 411 （6835）：380-384。