材料和试剂

cDNA文库的构建
1. 逆转录病毒pESY-Neo载体（用于构建cDNA文库是pEYK3.1载体的修饰版本[来自Whitehead研究所George Daley博士实验室的礼物]）
2. DNeasy ®组织试剂盒（QIAGEN，目录号：69504）
3. Oligotex poly（A） + RNA纯化柱（QIAGEN，目录号：70042）
4. 具有Gateway ®技术的SuperScript ®质粒系统，用于cDNA合成和克隆（Invitrogen Life Technologies，目录号：18248013）＆nbsp;
5. Tris-Borate-EDTA（TBE）缓冲液（Amresco，10x浓缩液，目录号：0658-4l）
6. 超纯琼脂糖（Invitrogen，目录号：16500-100）＆nbsp;
7. XL-1 Gold Ultracompetent细胞（Stratagene，目录号：200315）
8. QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
9. Plasmid Mega / Giga纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：12781）
逆转录病毒的产生和滴定
1. Phoenix-amphotropic逆转录病毒产生细胞（Phoenix-AMPHO ATCC ® CRL-3213 TM ）
2. Dulbecco的改良鹰介质（DMEM，高葡萄糖）（Gibco，Life Technologies，目录号：11965092）
3. 胎牛血清（Gibco，目录号：16000044）
4. 200 mM L-谷氨酰胺（Gibco，目录号：25030081）
5. Lipofectamine TM 2000（Invitrogen，目录号：16680190）
6. 0.45μMSFCA膜注射器过滤器（Corning Incorporated，目录号：443220）
7. NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞（ATCC，目录号：CRL-1658）＆nbsp;
转录病毒cDNA文库＆nbsp;
1. 逆转录病毒cDNA文库上清液＆nbsp;
2. Polybrene（Hexadimethrine bromide，Sigma-Aldrich，目录号：H9268）
细胞培养
1. 移液器吸头和无菌血清移液器
2. 100-mm组织培养处理的培养皿（BD Biosciences，目录号：353003）＆nbsp;
3. 组织培养处理多孔板，48孔（BD Bioscience，目录号：353078）
4. Falcon管，聚丙烯，50毫升（BD Biosciences，目录号：352095）
5. Falcon管，聚丙烯，15毫升（BD Biosciences，目录号：352096）
6. 精细火焰绘制的巴斯德吸管
  精细巴斯德吸管由商业巴斯德吸管（VWR，目录号：14673-043）制成。在本生灯的火焰上将移液管的尖端加热几秒钟，使用镊子迅速拉出火焰，并切割移液管的尖端以获得合适的直径。＆nbsp;
7. （可选）Hamilton TM Micro-syringe
  注意：火焰吸管非常锋利。小心轻放。移液器应在使用前进行高压灭菌和干燥。
8. HMT3522 T4-2细胞（或任何可以'恢复'到表型正常表型的上皮癌细胞系）
9. Dulbecco的改良Eagle's培养基（DMEM / F12，Thermo Fisher Scientific，目录号：12400-024）＆nbsp;
10. 胰岛素（250 ng / ml，Sigma-Aldrich，目录号：I6634）
11. 转铁蛋白（10μg/ ml，Sigma-Aldrich，目录号：T2252）
12. 亚硒酸钠（2.6 ng / ml，BD Bioscience，目录号：354201）
13. 雌二醇（10 -10 M，Sigma-Aldrich，目录号：E2758）
14. 氢化可的松（1.4 x 10 -6 M，Sigma-Aldrich，目录号：H0888）
15. 催乳素（5μg/ ml，Sigma-Aldrich，目录号：L6520）
16. 0.25％（wt / vol）胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200-056）＆nbsp;
17. 大豆胰蛋白酶抑制剂（10 mg / ml，Sigma-Aldrich，目录号：T6522）
18. Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S9390）
19. KH 2 PO 4 （J.T.Baker Inc.，目录号：3246-01）
20. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
21. KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
22. H14完全培养基（无表皮生长因子）（见食谱）
23. 1x PBS（见食谱）
3D lrECM培养的表型逆转测定＆nbsp;
1. 无LDEV生长因子减少基底膜基质（Matrigel TM ，Corning，目录号：354230; Cultrex TM ，Trevigen，目录号：3433-001-01）＆nbsp;
2. G418硫酸盐（Thermo Fisher Scientific，目录号：10131027）选择稳定转导的细胞
3. 信号通路抑制剂（EGFR-TKI AG1478，EMD Millipore，目录号：658652; LY294002，Biomol，目录号：L7751;拉帕替尼或吉非替尼是来自加州大学旧金山分校的Catherine Park的礼物，但它们也可在Sigma-Aldrich商购获得）
验证所选克隆
1. Dispase II（中性蛋白酶，II级）（Sigma-Aldrich，目录号：4942078001）
2. DNeasy ®组织试剂盒（QIAGEN，目录号：69504）
3. 克隆载体中侧翼序列的引物＆nbsp;
4. LA Taq DNA聚合酶（远程高保真聚合酶链反应（PCR）酶）（Takara Bio，目录号：RR002）
5. pGEM ® -T Easy克隆载体（Promega，目录号：A1360）

设备

移液器
水套CO 2 培养箱（Thermo Scientific Forma，型号：Forma TM 系列II 3120）
离心机（Eppendorf，型号：5804）
倒相显微镜（尼康，型号：Eclipse TS100）
生物安全柜＆nbsp;
Gene Pulse ®电穿孔比色皿（Bio-Rad，目录号：1652089）
电穿孔系统（Bio-Rad Gene Pulser ® II电穿孔系统，目录号：1652105-1652110）
Fluorchem TM 8900凝胶成像系统（Alpha Innotech，型号：8900）＆nbsp;
PCR热循环仪＆nbsp;
（可选）微操纵器（Burleigh，型号：PCS5000）

程序

cDNA文库的构建
用于该方案的逆转录病毒cDNA文库的构建如前所述进行（Lee et al。，2012）。
1. 从HMT3522 T4-2细胞中提取总RNA。＆nbsp;
2. 将总RNA应用于Oligotex poly（A） + RNA纯化柱，并根据制造商的方案（QIAGEN）纯化mRNA。
3. 使用SuperScript ®质粒系统合成双链cDNA，使用Gateway ®技术进行cDNA合成和克隆，按照制造商的说明（Invitrogen life technologies）进行。
4. 在0.5％TBE缓冲液中以30W在0.7％琼脂糖凝胶上运行cDNA用于大小分级。
5. 切除尺寸范围为0.5至5 kb的DNA片段，并根据制造商手册（QIAGEN）用琼脂糖凝胶提取试剂盒纯化该部分。＆nbsp;
6. 通过将纯化的cDNA在10μl反应中与线性化的逆转录病毒pESY-Neo载体混合进行连接反应，并在4℃下孵育16小时。
7. 使用Bio-Rad基因脉冲控制器®以100欧姆和25μF将2μl连接混合物电穿孔到0.1cm电穿孔杯中的XL-1 Gold Ultracompetent细胞中。
8. 将转化的细菌在含有50μg/ ml卡那霉素的150mm LB平板上铺板，并在37℃下孵育16-18小时。
9. 使用Fluorchem TM 成像系统（Alpha Innotech）的自动计数程序计算平板中转化的大肠杆菌菌落的数量，确定文库的复杂性。＆nbsp ;
10. 从平板上轻轻刮去菌落，用质粒Mega纯化试剂盒（QIAGEN）分离质粒DNA。＆nbsp;
注意：我们通过将平板上的菌落数乘以合并的文库（ml）的体积来计算我们文库的滴度（CFU / ml）。得到的逆转录病毒cDNA文库的复杂性约为5 x 10 4 CFU / ml，平均插入片段大小为1.2 kb。
逆转录病毒的产生和滴定
1. 在含有10％（体积/体积）FBS和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中，在100-mm组织培养处理的培养皿上生产细胞密度为1.5×10 6 细胞的凤凰双嗜性逆转录病毒细胞转染。＆nbsp;
2. 根据制造商手册（Invitrogen），使用Lipofectamine 2000用10μgcDNA质粒转染。＆nbsp;
3. 将培养物孵育48小时。
4. 收获含有培养基的逆转录病毒并通过0.45μm注射器过滤器过滤。
  注意：上清液可在-80°C下冷冻备用。
5. 如Kwon et al。（2003）中所述，确定收获的逆转录病毒的滴度。
转录病毒cDNA文库＆nbsp;
1. 在H14完全培养基中的100mm培养皿上以1×10 4 sup / ml细胞/ cm 2 的密度培养靶细胞12-18小时，然后在37℃转导。在5％CO 2 的气氛中的加湿培养箱中的℃。
2. 从细胞中取出培养基，加入Polybrene的病毒颗粒，浓度为8μg/ ml。
3. 将细胞与含有病毒的培养基在37℃下在潮湿的培养箱中在5％CO 2 的气氛中孵育8-16小时。
4. 取出含病毒的培养基，在培养液中加入10 ml新鲜培养基。＆nbsp;
5. 将培养物在37℃下在潮湿的培养箱中在5％CO 2 的气氛中孵育48小时。
6. 用含有G418的新鲜H14完全培养基替换培养基，浓度为
  250μg/ ml用于选择携带整合cDNA进入基因组的细胞。
  注意：我们这里使用的是新霉素抗性基因，但嘌呤霉素抗性基因作为选择标记是优选的，因为选择时间通常比新霉素或潮霉素抗性基因短。＆nbsp;
顶级3D培养试验
为了研究重建基底膜中乳腺上皮细胞的功能分化和肺泡形态发生，已经开发了几种3D细胞培养技术（Petersen et al。，1992; Kaminker et al。，2005; Lee et al。，2007）。在嵌入式3D测定中，将细胞培养在富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）凝胶中，例如Matrigel TM 。在“On-Top”3D测定中，将细胞培养在lrECM涂层上，并将含5％（vol / vol）lrECM的培养基滴在细胞顶部以提供富含3D层粘连蛋白的环境。在两种测定中，细胞形成适当的细胞 - 细胞和细胞 - ECM相互作用，并重现生理和功能相似的极化肺泡结构，如体内。嵌入式3D测定与On-Top之间的差异在于，由于细胞被封装在lrECM（Matrigel TM ）内，嵌入式测定更严格地控制了菌落的形态和生长速率。电镀时间。因此，嵌入式方法为细胞提供了更均匀的物理限制和生物化学提示。该方法对形态学研究最有用。然而，嵌入的方法需要10天才能完成，并且菌落很难从凝胶中除去。在这项研究中，我们采用On-Top 3D培养，因为：（1）非恶性和恶性细胞之间的增殖和形态差异可以通过培养5天来区分。（2）使用精细火焰喷射的淹没玻璃移液管或显微操纵注射器针头可以容易地从培养物中分离菌落。该测定在第五天结束，以最大限度地减少可能由不太严格的顶级3D文化设置产生的伪影。
1. 用850μl冷基质胶®涂抹60 mm培养皿，37°C孵育20-30分钟。
  注意：Matrigel ® 应在-80°C下保存，并在使用前在冰上解冻过夜。它在温暖时迅速凝固。因此，它应始终保持在冰上。重要的是将Matrigel涂覆的板孵育建议的时间以实现Matrigel的适当凝胶化（表1）。
  
  表1. 3D On-Top文化的建议体积和细胞数
2. 用0.25％胰蛋白酶在37℃下将细胞层移至单细胞中3分钟。
  注意：细胞完全解离成单个细胞至关重要，否则结块将导致3D lrECM培养中的假阳性。
3. 计数细胞，将6×10 5个细胞转移到15ml锥形管中，并通过在130℃下在室温下离心5分钟使它们沉淀。
4. 将细胞重悬于2,500μlH14完全培养基中的单个细胞。这是建议的生长培养基体积的一半。
  注意：细胞必须彻底分离到单个细胞，因为细胞聚集会导致3D lrECM培养物出现假阳性。在生长培养基中添加浓度为250μg/ ml的 G418 ，以选择含有整合cDNA的细胞。
5. 将细胞铺在凝胶化的基质胶表面，让它们在37℃的培养箱中静置10分钟。＆nbsp;
6. 向剩余的2250μl冷H14培养基中加入250μlMatrigel和G418。
7. 将Matrigel和G418混合的H14培养基逐滴加入到培养的培养物中。＆nbsp;
8. 维持培养5-7天，每隔一天用G418替换生长培养基。
从顶部3D培养测定和所选克隆的扩增中分离克隆
1. 取出培养基，用5 ml无菌PBS短暂冲洗。
  注意：在使用前，将培养基和Dispase II在37°C水浴中预热10分钟。
2. 将培养物与1-5ml Dispase II溶液（2U / ml）在37℃下在培养箱中孵育30分钟，以使菌落从Matrigel轻轻解离。＆nbsp;
3. 在BioSafety柜中的相差显微镜下使用精细火焰绘制的巴斯德吸管将已经生长成大簇的菌落分离并且未能“恢复”为表型“正常”结构（图3A和3C）。 /> 注意：特别注意无菌技术;在将显微镜放入BioSafety机柜之前，用70％乙醇或其他消毒剂擦拭显微镜是很重要的。
  （可选） Hamilton TM Micro-syringe附加的Micromanipulator是收集菌落的另一种选择（图3D）。
4. 将分离的菌落转移到48孔组织培养板中，加入250μg/ ml含G418的H14培养基用于继续培养。
5. 为了放大，逐渐将您挑选的细胞扩大到更大的平板。
  
  图3.分离对3D lrECM培养中的表型逆转具有抗性的菌落。 A.将表达恶性T4-2细胞的cDNA铺板并用EGFR-TKI AG1478处理。将培养物维持5天，并且隔天用EGFR-TKI AG1478和250μg/ ml G418将培养基更换为新鲜。选择大于100μm的菌落。选择的抗性菌落被圈出。 B.将每个分离的菌落分别转移到多孔板中，扩增至足够数量的细胞，用EGFR-TKI AG1478和250μg/ ml G418重新铺板于3D lrECM培养物上，并重复分离过程以进行富集。孤立的克隆。选择的抗性菌落用箭头表示。 C.通过细尖巴斯德吸管在生物安全柜中的相差显微镜下分离细胞簇。 D. Hamilton TM Micro-syringe附加的微操纵器（Burleigh PCS-5000）是收集菌落的另一种选择。 A，B，C中的比例尺=50μm。
选择克隆的鉴定和验证
1. 使用DNeasy Tissue Kit按照制造商的说明（QIAGEN）从35mm组织培养皿（约5×10 5个细胞培养皿）上培养的所选克隆中提取基因组DNA。
2. 运行聚合酶链反应（PCR）以使用病毒载体中的侧翼序列回收cDNA插入物（图4）。
  注意：基因组DNA的PCR反应必须使用适合扩增远程DNA片段（> 1 kb）的Taq DNA聚合酶进行。
  
  图4.使用逆转录病毒克隆载体的侧翼序列通过PCR回收的14个代表性cDNA插入片段用于测序分析
3. 将PCR反应中的DNA片段扩增到pGEM-T亚克隆载体中。＆nbsp;
4. 进行DNA测序。＆nbsp;
5. 分析序列同源性以确定整合的cDNA的身份。
  注意：不包含框内cDNA插入的克隆应排除在候选者之外。
第二轮筛选选定的克隆
1. 按照程序B-C中的步骤重复筛选程序以富集所选克隆（图3B）。＆nbsp;
2. 逐渐地，独立地，在单层上扩展选定的菌落。＆nbsp;
3. 分析候选基因的生物学功能。＆nbsp;

笔记

体内，基底膜对组织形态发生和组织特异性结构和功能的维持至关重要。为了提供生理学相关的体外模型，重建的基底膜可以由Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤分泌的凝胶状混合物的提取物制成，其可以商品名Corning <商购获得。 sup>®基质胶®基质和Cultrex ® 3-D培养基质 TM 。这些基质的主要成分是层粘连蛋白（~60％），IV型胶原蛋白（~30％）和entactin（~8％），我们将它们称为富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）。我们选择蛋白质浓度范围为10至12mg / ml且具有低水平的内毒素（<2U / ml）的基质胶。由于批次之间的差异，我们通常在使用前测试多批次并大量购买以确保重现性。基质胶批次的测试标准包括形态学，细胞增殖，极性，整合素和EGFR的水平。＆nbsp;
该测定的概念包括哺乳动物细胞中cDNA文库的功能获得，其中文库中每个基因的表达增加反映了读数。具有比我们在此使用的病毒滴度更高的病毒滴度的更雄心勃勃的cDNA文库将增加从筛选中鉴定更多候选基因的机会。此外，在500bp和4kb之间的cDNA插入物的大小范围对于获得全长富集的cDNA文库是至关重要的。使用了复杂的大约5 x 10 4 菌落形成单位（CFU）和平均插入片段大小为1.2 kb的逆转录病毒cDNA文库，我们的筛选产生了85个对信号传导抑制剂具有抗性的菌落。其中35个菌落含有cDNA插入物。排除不表达开放阅读框cDNA的克隆后，鉴定出5个候选基因（表2）。一旦鉴定出含有目的基因的克隆，就必须使用不同的癌细胞系和/或动物模型对其进行验证（图5）。

表2.从屏幕上恢复的候选基因

图5.赋予对EGFR抑制剂的抗性的FAM83A的验证 A.将载体对照或过表达T4-2细胞的FAM83A接种在具有回复化合物EGFR-TKI AG1478的3D lrECM中。 B.用于载体对照或FAM83过表达SKBR3细胞的拉帕替尼的IC 50 。 C.在3D lrECM培养物中对载体对照或过表达T4-2细胞的FAM83A的拉帕替尼或吉非替尼的药物反应。 D.来自在裸鼠中异种移植的载体或FAM83A过表达T4-2细胞的肿瘤生长。（C）和（D）改编自Lee 等人的图3和4 （2012）。 A，C =50μm的比例尺。
尽管列出了多个步骤，但我们认为在生理相关条件下的功能性筛选将产生重要的候选基因，以增加发现导致化疗耐药性的靶途径的机会。此外，这些数据将提供关于这些候选基因如何在体内进行的重要见解。

食谱

H14完全培养基（无表皮生长因子）
DMED / F12
250 ng / ml胰岛素
10μg/ ml转铁蛋白
2.6 ng / ml亚硒酸钠
1.4×10 -6 M氢化可的松
10 -10 Mβ-雌二醇
5μg/ ml催乳素
1x PBS（pH 7.4）
8mM Na 2 HPO 4
2mM KH 2 PO 4
137 mM NaCl
2.7 mM KCl

致谢

我们感谢Drs。 Richard Schwarz，Joni Mott和Claire Robertson批判性地阅读了手稿。这项工作得到了美国国防部创新奖（W81XWH0810736），乳腺癌研究基金会（BCRF）和美国国立卫生研究院项目拨款计划（R01CA064786）的Mina Bissell的资助。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

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