设备

Linux / Unix集群
在这项研究中，我们使用Purdue Halstead超级计算机，它总共包含508个节点。每个节点包含20个内核，两个10核Intel Xeon-E5处理器和128 GB内存。有关更多信息，请访问网站： https://www.rcac.purdue.edu/compute/霍尔斯特德功能。
用于后期数据处理的个人计算机（联想，T430s，英特尔酷睿i5-3320M CPU，4 GB RAM）

软件

Blastall或Blast +（Altschul et al。>，1997）， https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&DOC_TYPE=Download
该程序由NCBI开发和分发，用于进行爆炸搜索。
MCScanX（Wang et al。>，2012）， http://chibba.pgml .uga.edu / mcscan2 /
该工具包用于基因同线性和共线性的检测和进化分析。该程序还可以生成串联重复的基因。＆nbsp;
Log-Expectation的多序列比较（MUSCLE）（Edgar，2004）， https://www.drive5.com/肌肉/
ClustalW（Thompson et al。>，1994）， http://www.clustal.org / clustal2 /
Muscle和ClustalW都是用于核苷酸和蛋白质序列的多序列比对的软件。
通过最大似然（PAML）进行系统发育分析（Yang et al。>，2007）， http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html
PAML是一系列程序，用于使用最大可能性对DNA或蛋白质序列进行系统发育分析。
分子进化遗传学分析（MEGA X）（Kumar et al。>，2018）， https：// www.megasoftware.net/
该软件包含许多用于系统发育分析的复杂方法和工具，包括构建系统发育树以及进化距离估计。
Perl， https://www.perl.org/ 或Python， https://www.python.org/ ，编程语言
这些语言可以对从上面使用的某些软件生成的主要数据进行后处理。
SAS软件， https://www.sas.com/en_us/home.html < br /> SAS是一种用于统计分析的软件。

程序

密切相关物种中同源基因的鉴定
1. 检索基因序列
  对于可获得基因组注释的给定植物基因组，从相应的数据库下载所有蛋白质编码基因的编码序列（CDS）和蛋白质序列。有些物种有各自的网站，例如拟南芥> TAIR（ https://www.arabidopsis.org / ），大豆SoyBase（ https://soybase.org/ ）和玉米MaizeGDB（ https://www.maizegdb.org/ ）， etc >。许多其他物种的序列保存在NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih。 gov / ），CoGe（ https://genomevolution.org/coge/ ），Phytozome（ https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html ）或其他相关数据库。我们从Phytozome下载了大豆的所有基因组序列和基因注释（v1.1，Schmutz等，2010）和普通豆（Schmutz et al。>，2014）。
2. 去除转座子相关和假设的蛋白质
  为了在密切相关的物种中检测高度可靠的syntelogs，首先使用BLAST去除转座子相关和假设的蛋白质（Altschul 等人，>，1997）。以大豆（v1.1）为例，来自20个大豆染色体的总共53,927个注释基因针对大豆转座子数据库SoyTEdb进行了BLASTN查询（Du et al。>，2010， https://www.soybase.org/soytedb/ ）。去除了与转座子相关序列匹配的总长度的80％以上的序列相似性大于80％的任何基因。注释为假设蛋白质的基因也被排除在外（图1）。这是进行局部爆炸的典型环境。
  
  formatdb -i SoyBase_TE_Fasta.txt -p F -o T >
  blastall -p blastn -i Soybean_gene_cds.fa -d SoyBase_TE_Fasta.txt -m 8 -a 8 -o Soybean_gene_cds_blast_TEs >
  
  注意：基于基因注释文件识别假设蛋白质。注释为假设蛋白质的基因不包括在分析中。这里formatdb用于格式化核苷酸源数据库“SoyBase_TE_Fasta.txt”，然后才能使用blastall进行搜索。 blastall用于将文件“Soybean_gene_cds.fa”中的基因序列与数据库“SoyBase_TE_Fasta.txt”进行比较。有关每个参数的详细说明，请参阅软件手册。>
  
  图1.生物信息学管道，用于鉴定和比较大豆和普通豆中的同线同源基因。实心圆圈和虚线圆圈分别表示相应基因组中基因的存在与否。 GmA和GmB代表大豆中的任一重复基因。 Gm， Glycine max >，大豆; Pv， Phaseolus vulgaris >，普通豆。这个数字是从赵等人>，2017年修改过来的。
3. 候选syntelogs的检测
  大豆和普通豆中剩余的蛋白质编码基因用于使用默认参数进行全对抗BLASTP搜索，E值截止值为10 -10 （Altschul et al 。>，1997）。对于每对基因，将BLAST命中加载到软件MCScanX（Wang et al。>，2012）以扫描syntelog同源基因对。
  
  blastall -p blastp -i Soybean_gene_pep.fa -d Commonbean_gene_pep.fa -m 8 -a 8 -FF -o Soybean _blast_Commonbean >
  MCScanX Soybean_CommonBean >
  
  注意：E值的设置基于粗略的发散时间。如果发散时间未知，您可以将其保留为默认设置。请为MCScanX准备所有基因位置所需的gff文件。使用MCScanX的默认设置（匹配分数= 50，匹配大小= 5，间隙罚分= -1，重叠窗口= 5，最大间隙= 25和E值截止10 识别大豆和普通豆之间的同步基因对-10 ）。>
4. 后期处理候选星系基因
  由于大豆在与普通豆分裂后经历了全基因组重复，因此普通豆基因组中的基因对应于大豆基因组中的一个或两个拷贝，这取决于保留在大豆中的基因的重复状态。除了syntelogous基因对之外，MCScanX还提供了所有同源基因对。为了去除假阳性星系基因，引入了来自参考基因组的重复区段信息（Schmutz et al。>，2014），以保持在重复区域中检测到的同源基因对并显示出同线关系。大豆和普通豆之间。
  ＆NBSP;候选同位素基因的最终列表的实例显示在表1中。参与串联重复的基因具有模糊的保留状态，因此被搁置以进行单独分析。
  
  表1.在普通豆和大豆基因组中鉴定的同线同源基因的实例
  
  ||在同线区域未检测到基因。
Syntelogous基因进化距离的估算
1. 序列比对
  尽管许多基因具有几种替代转录物，但仅使用基于基因注释的基因的初级转录物来估计大豆和普通豆的不同同线性基因之间的序列差异。使用默认参数使用MUSCLE程序（Edgar，2004）或ClustalW（Thompson 等人，1994）比对同线基因的核苷酸序列。 Jalview可以查看对齐情况（图2A）。
  
  肌肉-in输入输出或clustalw输入>
  
  注意：基因的初级转录本是根据基因注释文件确定的，该文件显示了基因的主要转录本。 MUSCLE或ClustalW一次只能运行一组syntelog。对于全基因组水平分析，我们建议作者编写Perl或Python脚本以自动将每对序列加载到MUSCLE或ClustalW以进行对齐。在此步骤中，我们首先使用MUSCLE运行比对，然后对剩余的基因对执行ClustalW，其中核苷酸比对在MUSCLE比对后不是整数倍的三倍。＆nbsp; >
2. 手动检查
  手动检查输出比对以修改错误排列的核苷酸。此步骤非常重要，但如果要验证的数据量非常大，则可能不实用（图2B）。
  
  图2.大豆和普通豆中同线同源基因的序列比对的一个例子。：一种。由MUSCLE生成的原始对齐（Edgar，2004）。 B.手动修改对齐。蓝框表示修改后的区域。
3. 序列分歧
  使用Perl或Python编程通过PAML软件将同线性基因的所有成对比对制备成所需格式，以使用具有默认参数的yn00和baseml模块计算非同义（Ka）和同义（Ks）替换，除了模型被设置为1而不是0（Yang，2007）。有关在PAML包中运行程序的更多信息，请参阅手册。
系统发育分析
系统发育树用于表示同源基因之间的系统发育关系。
1. 序列对齐
  使用MUSCLE程序（Edgar，2004）或ClustalW（Thompson 等人，1994）使用默认参数比对同线性基因的核苷酸序列或蛋白质序列。
  
  肌肉-in输入输出或clustalw输入>
2. 系统发育树构建
  将同源基因的序列比对转移到MEGA软件中，使用针对核苷酸序列整合的邻接最大复合似然模型和具有成对缺失的蛋白质序列的泊松校正来构建系统发育树（Kumar et al。 >，2018）。 Bootstrap值从1,000次重复计算。

数据分析

执行学生的 t > - 测试以使用SAS软件比较重复项和单项之间的进化距离。进一步进行Bonferroni校正以校正 P >值。 P >＆lt; 0.05被认为是显着的，并且 P > <0.05。在Bonferroni校正下，0.0001被认为是重要的。实验值报告为平均值±标准偏差或方框图（图3）。

图3.大豆中重复和单体之间进化距离的比较。通过大豆和普通豆的成对比较计算Ka和Ks。统计分析由学生 t > - 测试进行。 **， P >＆lt; 0.0001。 Ka，非同义替代; Ks，同义替换; ω，Ka / Ks。框的底部和顶部边界是第一个和第三个四分位数，单个框内的粗线是中位数，它们被称为第二个四分位数。晶须的末端（虚线）表示数据的最小值和最大值。

笔记

由于潜在的基因转座，一些指定的单一基因，其同源物未在同线区域中发现，可能属于重复对。单体的同源物可以从原始同线区转移或易位到基因组的其他地方，而不是被删除。＆nbsp;
参与串联重复的基因总是具有模糊的保留状态，因此被单独分析。

致谢

该协议改编自Zhao 等人>（2017）。这项工作得到了联合大豆委员会和印第安纳州大豆联盟的大豆核查资金和国家科学基金会资助DBI-0822258到J.M.，国家科学基金会资助DBI-1237931到D.L.的支持。和Purdue Startup Funds到D.L，以及迈阿密大学创业基金到M.Z.

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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