材料和试剂

玻璃幻灯片
盖玻片
选择的标本： Caenorhabditis elegans >在体壁肌肉线粒体中表达GFP（菌株SJ4103）
10 mM叠氮化钠（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）
琼脂糖

注意：在我们的例子中，我们使用成年> Caenorhabditis elegans > 在体壁肌肉线粒体中表达GFP（菌株SJ4103）;该菌株来自Caenorhabditis Genetics Center（CGC）。我们使用10mM叠氮化钠（Sigma Aldrich，St.Louis，MO）固定动物，并将它们安装在覆盖有盖玻片的载玻片上的2％琼脂糖垫上（Shaham，2006）。>

设备

LSM 510共聚焦显微镜（ZEISS，型号：LSM 510）或相机获取图像
注意：在本例中，我们使用共聚焦成像在具有40倍物镜的Zeiss LSM 510共聚焦显微镜上对线虫的体壁肌肉进行成像。>

软件

Blinder（Solibyte Solutions，Durham，NC; http://blinder.solibytesolutions.com/ ） - 适用于Windows仅限操作系统
注意：该软件也存档在Zenodo上（DOI：10.5281 / zenodo.1464815）。>
图像处理软件准备图像进行评分
FIJI（ImageJ的发行版 https://fiji.sc/ ）
统计软件来分析数据
GraphPad Prism 7.04（ https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）

注意：在此协议中，我们使用FIJI（ImageJ的分布）生成共焦堆栈的Z投影，并在加载到评分软件之前裁剪图像以仅包括来自单个动物的体壁肌肉。我们使用GraphPad Prism 7.04来统计分析视觉评分中的数据。>

程序

获取待评分标本的图像
在该示例中，通过用1mW功率的488nm激光扫描以及100ms曝光来获取图像。体壁肌肉在后部区域成像，位于尾部前方，以避免混淆来自肠道的自发荧光。从相对于-15μm开始以0.5μm间隔开始拍摄21张图像（图1）。

图1. 8天成人的代表性共聚焦堆（0.5μm切片） C.线虫 > 线虫在体壁肌肉线粒体中表达GFP。切片根据堆叠中的位置编号。体壁肌肉线粒体在切片5-12中在图像的大部分上清楚地出现，并且也在切片13-21中沿着下边缘存在。
处理图像以获得每个样本的单个，隔离且清晰可辨的图像
在我们的研究中，我们使用FIJI为共焦叠加产生最大强度Z-投影，并使用裁剪图像显示来自单个动物的体壁肌肉（图2）。通过将所有图像作为堆栈打开，然后选择图像，堆栈，Z项目来创建Z投影。在对话框中，我们选择了所有切片和投影类型“Max Intensity”。

图2.图1中显示的来自共焦堆栈的代表性裁剪Z投影。最大强度用于Z投影类型。
为您的标本/表型确定合适的评分系统
在这里，我们创建了一个1-5评分系统来分类与线粒体的年龄相关的退化。在该系统中，相对“健康”得分为1的线粒体显示出丰富的网状线粒体，没有“泡”（大而明亮的GFP结构），线粒体之间没有空间（网络中断）。随着分数从1增加到4，线粒体变得越来越分散（网络中断），稀疏和疱疹。最后，得分为5表示在成像的肌肉区域中没有线粒体（如图3所示，得分5的实例仅显示自发荧光）。

图3. C中线粒体网络的评分系统。线虫 > 体壁肌肉。评分范围从健康（评分1）到严重退化（评分4-5）表现为动物年龄时出现（改编自Hartman et al。>，2018）。
将图像加载到Blinder软件：“添加图像组”。点击“添加组”以添加每个治疗组的图像。＆nbsp;
定义质量控制参数。选择您希望重复的图像数量（占总图像的百分比），以确保评分与多个查询一致。有关质量控制最佳实践的建议，请参阅“注释”。＆nbsp;
在软件中定义在步骤3中开发的评分系统。最好包括每个类别的数值（即>，在我们的例子中为1-5）和选择的简短描述用于提醒用户定义类别的标准。可以使用“保存”按钮保存此评分系统以备将来使用。＆nbsp;
为你的图像打分！图像将随机呈现给用户，用户可以使用键盘分配分数（键入开始每个分数的数字或字母将自动填入下拉菜单），或者通过下拉菜单中的分数选择分数。鼠标（见图4中的截图）。

图4.显示随机显示图像的分数选择的屏幕截图。请注意，图像集的进度显示在屏幕顶部（在这种情况下为75/170），并且用户具有如果错误地分配了错误的分数，则返回上一图像的选项。
在软件的摘要和质量控制窗口中浏览结果（参见图5中的屏幕截图）。然后可以使用“保存结果”按钮以.csv格式导出结果。

图5.结果截图。面板A显示的摘要显示每个评分类别中每个非盲组（在本例中为控制和练习）的图像数量。面板B给出了原始结果，表明每个文件的分数（作为完整路径给出）。面板C显示质量控制或重复图像的结果。红色箭头突出显示质量控制失败（分数不匹配）的图像。如果评分质量控制失败，请参阅“注释”部分。

数据分析

对于数据分析，大多数具有包括3个或更多可能类别的评分系统的应用程序将需要分类统计测试，例如卡方分析。在我们的例子中，我们使用卡方检验来比较三种不同的治疗组（对照组，短暂食物剥夺的动物和经过游泳运动训练的动物）。为了分析，将表现出每个分数的动物的实际数量（来自盲法分类）输入GraphPad prism“Grouped Analysis”表。然后进行卡方检验以全球比较三组并测试显着性。我们发现第8天组间分数的分布没有显着差异，但在第12天发现了显着差异（Hartman et al。>，2018）。

笔记

关于收集和评分图像的注意事项：虽然我们认为这个过程通常可以无偏见地进行，但有必要对实验设计进行判断。实验者应该考虑以下因素：＆nbsp;
1. 不应该通过查看图片来确定治疗组的身份（例如，某些群体的身体/细胞大小是否不同）。＆nbsp;
2. 图像的总数应该足够大，以致实验者不能回想起属于特定组的特定图像。如果样本数量很少，最好让另一位实验者参与确保没有偏见。
3. 如果可能，应在不同日期进行图像采集，处理和评分，以避免回忆特定图像。
4. 如果对图像回忆有任何疑虑，我们建议让多个实验者加载和评分图像。
5. 由于在评分过程中图像必须能够舒适地放在用户的显示器上，因此在加载到软件之前，某些图像需要进行预处理。可以采用裁剪，宽高比调整，尺寸调整和亮度/对比度操纵，使得图像以可识别的格式呈现 - 并且这可以是偏见的来源。为了确保用户不通过操纵单个非盲图像来引入偏差，在可能的情况下，应该“批量”对整个图像集进行调整。例如，如果需要增加对比度，请考虑在所有图像上使用“自动”对比度，以避免手动操作单个非盲图像。＆nbsp;
软件中的质量控制功能允许用户在分析过程中请求重复一定百分比的总图像。这确保了用户在评分中是一致的，并且还可以允许评估新训练的人是否已经达到熟练程度，允许他们以与训练有素的专家相当的方式使用评分量规。如果任何图像的质量控制失败，用户应考虑评分为何不一致，并考虑修改评分系统。下面概述了两个突出的例子：
1. 在某些情况下，可能会出现与评分系统中包含的表型不同的意外表型。这可能是系统中现有类别之间的中间表型，或者可能是评分系统完全未描述的表型。在任何一种情况下，这种类型的失败都需要将额外的分数选项添加到评分系统中。
2. 或者，在某些情况下，用户定义的评分系统可能提供比视觉检查更精细的区分。例如，得分“2”可能与得分“3”无法区分，并且用户经常无法在这两个类别中一致地对图像进行分类。在这种情况下，用户应将这两个分数折叠成评分系统中的单个分数。
其他应用：我们想象可能存在许多应用，包括非生物图像，用户需要盲目地对图像进行评分。以下是我们考虑过的一些例子。
1. 在教学和培训应用中，个人学习识别图像中的结构/形态，我们认为该软件可用于测试该人的识别准确性和精确度。该软件甚至可以用于教室（特别是实验室教室）设置。
2. 在自动图像分析的开发中，可以使用Blinder为这种自动化系统的性能提供专家视觉评分基准。

致谢

作者非常感谢Melissa Chernick（杜克大学，北卡罗来纳州达勒姆）和Ricardo Laranjeiro（罗格斯大学，新不伦瑞克，新泽西州）对该软件以前版本的beta测试的意见和建议。该方案中使用的菌株由 Caenorhabditis >遗传学中心（CGC）提供，该中心由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。该工作部分由NIEHS F32ES027306（J.H.H。），R01ES028218（J.N.M。）和P42ES010356（J.N.M.）资助。

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益申报。

参考

Barton，A.K.，Schulze，T.，Doherr，M。G.和Gehlen，H。（2018）。支气管肺泡灌洗对马的胸部X线摄影的影响。 J Vet Sci > 19（4）：563-569。
Bretman，A.，Lawniczak，M。K.，Boone，J。和Chapman，T。（2010）。交配插蛋白减少了 Drosophila melanogaster >中的早期雌性重建。>。 a> J Insect Physiol > 56（1）：107-113。
Bychkov，D.，Linder，N.，Turkki，R.，Nordling，S.，Kovanen，PE，Verrill，C.，Walliander，M.，Lundin，M.，Haglund，C。和Lundin，J。（2018））。基于深度学习的组织分析预测结直肠癌的结果。 Sci Rep 8（1）：3395。
Dhyani，M.，Gee，M。S.，Misdraji，J.，Israel，E.J。，Shah，U。和Samir，A.E。（2015）。使用实时剪切波弹性成像评估儿科和青少年患者肝纤维化的可行性研究。 J Med Imaging Radiat Oncol > 59（6）：687-694;测验751。
Esteva，A.，Kuprel，B.，Novoa，R.A.，Ko，J.，Swetter，S.M.，Blau，H.M。和Thrun，S。（2017）。深层神经网络对皮肤癌的皮肤科医生级分类。自然 542（7639）：115-118。
Fuchs，F.，Burlat，J.，Grosjean，F.，Rayssiguier，R.，Captier，G.，Faure，J.M。和Dumont，C。（2018）。基于分数的方法，用于在常规中期妊娠超声检查中对胎儿硬腭评估进行质量控制。 Acta Obstet Gynecol Scand >。 doi：10.1111 / aogs.13418
Gonzalez-Hunt，C.P.，Leung，M.C.，Bodhicharla，R.K.，McKeever，M.G.，Arrant，A.E.，Margillo，K.M.，Ryde，I.T.，Cyr，D.D.，Kosmaczewski，S.G.，Hammarlund，M。和Meyer，J.N。（2014）。 Caenorhabditis elegans >中线粒体基因毒素和多巴胺能神经变性的暴露。 PLoS One > 9（12）：e114459。
Green，RA，Kao，HL，Audhya，A.，Arur，S.，Mayers，JR，Fridolfsson，HN，Schulman，M.，Schloissnig，S.，Niessen，S.，Laband，K.，Wang，S。，Starr，DA，Hyman，AA，Schedl，T.，Desai，A.，Piano，F.，Gunsalus，KC and Oegema，K。（2011）。高分辨率 C.线虫>必需基因网络，基于复杂组织的表型分析。细胞> 145（3）：470-482。
Gulshan，V.，Peng，L.，Coram，M.，Stumpe，MC，Wu，D.，Narayanaswamy，A.，Venugopalan，S.，Widner，K.，Madams，T.，Cuadros，J.，Kim ，R.，Raman，R.，Nelson，PC，Mega，JL和Webster，DR（2016）。开发和验证用于检测视网膜眼底照片中糖尿病视网膜病变的深度学习算法。 JAMA > 316（22）：2402-2410。
Hartman，J.H.，Smith，L.L.，Gordon，K.L。，Laranjeiro，R.，Driscoll，M.，Sherwood，D.R。和Meyer，J.N。（2018）。 Caenorhabditis elegans >的游泳运动和短暂食物匮乏促进线粒体维持和保护化学诱导的有丝分裂毒性。 Sci Rep > 8（1）：8359。
Janowczyk，A。和Madabhushi，A。（2016年）。数字病理学图像分析的深度学习：包含所选用例的综合教程。 J Pathol通知> 7:29。
Passeri，M.J.，Cinaroglu，A.，Gao，C。和Sadler，K。C.（2009）。针对斑马鱼急性酒精暴露引起的肝脏脂肪变性需要甾醇调节元件结合蛋白激活。 Hepatology > 49（2）：443-452。
Riley，A.K.，Chernick，M.，Brown，D.R.，Hinton，D。E.和Di Giulio，R。T.（2016）。暴露于污染适应和未适应种群的青少年 Fundulus heteroclitus >的肝脏反应到伊丽莎白河沉积物提取物。 Toxicol Pathol > 44（5）：738-748。
Shaham，S。（2006）。细胞生物学方法。 C.线虫>研究社区， WormBook >，doi / 10.1895 / wormbook.1.49.1。