材料和试剂

塑料制品
1. 移液器吸头（2μl，20μl，200μl和1 ml）
2. 96孔聚苯乙烯圆底微孔板（Thermo Fisher Scientific，Nunc，目录号：12-565-214）
3. 微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
4. 15毫升锥形管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
细胞（这里我们使用从全血中纯化的人类原发性T淋巴母细胞。也可以使用其他细胞类型）
牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇，目录号：A7030）
Primaquine diphosphate（PQ）（西格玛奥德里奇，目录号：160393）
多聚甲醛，16％w / v水溶液。溶剂，不含甲醇（VWR，目录号：43368.9M）
缓冲区
1. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14040133）
2. Hanks平衡盐溶液，有或没有Ca 2 + / Mg 2 + （HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：14025092和14175095）
3. HEPES（赛默飞世尔科技，目录号：15630080）
抗体
1. LFA-1抗体：从hybridoma TS2 / 4.1.1（TS2 / 4.1.1，ATCC，目录号：HB-244）纯化的抗体
2. 次级Alexa Fluor ® 647驴抗小鼠IgG（H + L）（Thermo Fisher，目录号：A-31571）

设备

移液器（0-2.5μl，2-20μl，20-200μl，100μl-1 ml）
恒温箱
摆动式离心机用于微孔板
流式细胞仪（BD Biosciences，型号：LSR II）

软件

Flowjo，LLC（用于细胞计数分析的软件）

程序

表面LFA-1的标签（概述见图1）
1. 取3.4×10 7 细胞，用15ml冰冷的HBSS洗涤缓冲液（配方1）洗涤。＆nbsp;
2. 在4℃下以300 x g >离心10分钟。
3. 去除1×10 6 细胞用于未染色的对照，并将其在200μl3％PFA的迁移缓冲液（配方2）中在冰上固定20分钟，并在1ml冰冷的迁移缓冲液中洗涤两次并重悬于在PBS中加入200μl冰冷的2％FBS并储存直至在4℃下分析。
4. 将3.3×10 7 细胞（注释2）重悬于迁移缓冲液中的1ml冰冷的10μg/ ml TS2 / 4.1.1抗体中。＆nbsp;
5. 在冰上孵育30分钟。
6. 用10ml冰冷的迁移缓冲液洗涤一次。
7. 在4℃下以300 x g >离心10分钟。
8. 重悬于6毫升冰冷的迁移缓冲液中并保持在冰上直至使用。
图1. LFA-1回收分析的概述
标记细胞内LFA-1
1. 取1 ml TS2染色细胞，分成3个微量离心管（330μl细胞/管），加入0μl新鲜制备的30 mM PQ（注3）至一管（对照，0μMPQ）和1.1μlPQ至第二管（100μMPQ），最后3.3μlPQ到第三管（300μMPQ）。
2. 从步骤B1中的每个条件中取110μl进入96孔板的每个孔中，使时间点重复150分钟，并在37℃下孵育30分钟。
  注意：我们重复此程序120分钟，90分钟，60分钟，30分钟和0分钟的时间点。在每个时间点前两分钟（注4），我们按步骤B1所述准备PQ样品。准确地说，在时间点我们取出96孔板并在每个孔中加入110μl进行三次重复。每步完成后，将96孔板放回37°C培养箱中。>
3. 在最后孵育后取出96孔板并置于冰上并在0分钟时间点加入最后一式三份（110μl/孔）。
4. 向所有孔中加入100μl冰冷的迁移缓冲液，并在300℃下将板离心4℃，2分钟。
5. 将细胞重悬于冰冷的2μg/ ml驴抗-ms-AF647冰冷迁移缓冲液中，含0.1％BSA，20μl/样品。
6. 在冰上孵育20分钟。
7. 用200μl冰冷的迁移缓冲液洗涤两次，并将板在300℃下离心4℃，4℃离心2分钟。
8. 将具有3％PFA的细胞在冰冷的迁移缓冲液中在4℃下固定20分钟。
9. 用200μl冰冷的迁移缓冲液洗涤两次，并将板在300℃下离心4℃，4℃离心2分钟。
10. 重悬于PBS中的200μl2％FBS并转移至FACS管。
11. 使用流式细胞仪分析样品或在4°C储存直至分析。

数据分析

对于流式细胞术分析，使用FSC-A和SSC-A收集30,000个门控事件，以避免每个样品的死细胞。
然后通过使用FSC-A和FSC-H来分析细胞以对单个细胞进行门控，然后使用FL-4来分析不同时间点的直方图并计算平均荧光强度（MFI）。
要从所有样品中去除背景，从未染色的细胞中减去MFI，并从每个时间点和条件计算一式三份的平均值。
为了计算表面表达的相对％，我们使用0分钟的时间点作为100％;

表面表达式的相对百分比=将给定时间点的平均值除以时间点0的平均值。

当整合素首先内化时，您将首先看到减少，然后在一段时间后重新暴露表面上的整合素。在用PQ处理的样品中，与未处理的细胞相比，再次暴露将更低（例如，参见图2）。

图2.在存在和不存在PQ的情况下回收LFA-1的结果示例

笔记

每个样品取6×10个 5 细胞，每个时间点一式三份使用。因此，对于具有6个时间点的一个条件，细胞的总量是6×10 5个/ 5×10×10×1.08×10 10个细胞。
在PBS（= 13.86 mg / ml）中制备新鲜的30 mM Primaquine diphosphate（PQ）原液。＆nbsp;
要准备下一步，您需要或多或少2分钟的准备时间。你需要调整这个时间以适合你。
在这里，您可以为每个时间点使用新的96孔板，并调整时间并使用2板离心机，如果您想避免从培养箱中取出并进入板中。

食谱

HBSS洗涤缓冲液
没有Ca 2 + / Mg 2 + 的HBSS
10 mM HEPES
使用前在冰上预冷
迁移缓冲区
没有酚红（Gibco）的Ca 2 + / Mg 2 + 的HBSS
5mM Mg 2 +
10 mM HEPES
使用前在冰上预冷

致谢

该协议改编自Samuelsson 等人>（2017）。这项工作得到瑞典研究委员会奖项K2010-80P-21592-01-4和K2010-80X-215917-01-4，基金会OlleEngquistByggmästare，I＆amp; A Lundberg研究基金会，瑞典皇家科学院，皇家地理学会的支持。 Lund，ÅkeWiberg，Jeanssons Foundation，Kocks Foundation，P＆amp; U Schybergs Foundation，Gyllenstiernska Krapperup Foundation，Gustav V 80 Jubilee Fund，ÖsterlundFoundation，Nanna Svartz和Crafoord奖（LS）。 Anna-Greta Crafoord博士后奖学金和隆德皇家地理学会（KP）和隆德皇家地理学会（MS）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Evans，R.，Patzak，I.，Svensson，L.，De Filippo，K.，Jones，K.，McDowall，A。和Hogg，N。（2009）。整合免疫力。 J Cell Sci > 122（Pt 2）：215-225。
Ley，K.，Laudanna，C.，Cybulsky，M。I.和Nourshargh，S。（2007）。进入炎症部位：更新了白细胞粘附级联。 Nat Rev Immunol > 7（9）：678-689。
Samuelsson，M.，Potrzebowska，K.，Lehtonen，J.，Beech，J.P.，Skorova，E.，Uronen-Hansson，H。和Svensson，L。（2017）。 RhoB控制Rab11介导的LFA-1在迁移的T淋巴细胞中的再循环和表面再现。科学信号> 10（509）pii：eaai8629。
Stanley，P.，Tooze，S。和Hogg，N。（2012）。 Rap2在T细胞迁移过程中回收LFA-1扩展构象的作用。 Biol Open > 1（11）：1161-1168。
Svensson，L.，Stanley，P.，Willenbrock，F。和Hogg，N。（2012）。 Galphaq / 11蛋白通过循环促进整合素LFA-1的转换，促进T淋巴细胞迁移。 PLoS One > 7（6）：e38517。