材料和试剂

移液器吸头
盖玻片（直径32毫米）（VWR，目录号：631-0162）
6孔盘（SARSTEDT，目录号：833920）
微量离心管（SARSTEDT，目录号：72690.301）
96孔板（SARSTEDT，目录号：821581.0019）
PVDF膜（Thermo Fisher Scientific，目录号：88518）
白细胞（这里我们使用从全血中纯化的人类原发性T淋巴母细胞）
RhoB激活检测试剂盒（Cellbiolabs，目录号：STA-403-B）＆nbsp;
ICAM-1Fc（Biolegend，目录号：552904）
牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇，目录号：A1933）
Pierce TM Coomassie Plus Bradford测定试剂和BSA标准品（Thermo Fisher Scientific，目录号分别为23238和23209）
一抗
1. RhoB（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-180）或使用RhoB激活检测试剂盒中包含的RhoB抗体
2. LFA-1（m38）（GeneTex，目录号：GTX26132）
3. α-肌动蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A5441）
二抗
1. 山羊抗兔IgG-HRP（赛默飞世尔科技，目录号：31460）
2. 绵羊抗小鼠IgG-HRP（GE Healthcare，Amersham，目录号：NA9310V）
Pierce TM＆nbsp; ECLplus Western Blotting底物（Thermo Fisher Scientific，目录号：32132）
70％乙醇
5％奶粉
甲醇
缓冲区
1. HEPES（赛默飞世尔科技，目录号：15630080）
2. 蛋白酶抑制剂（cOmplete TM＆nbsp; Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail，Roche）（Sigma-Aldrich，目录号：11836170001）
3. 吐温20（赛默飞世尔科技，目录号：TA-125-TW）
4. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14040133）
5. Hank的平衡盐溶液（HBSS），有或没有Ca 2 + / Mg 2 +＆nbsp; （Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：14025092和14175095）
6. 2x还原SDS-PAGE缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：S3401-10VL）
7. HBSS洗涤缓冲液（见食谱）
8. 迁移缓冲区（参见食谱）

设备

移液器
钳子
离心机（冷冻微量离心机和带板支架的离心机）
摇杆/摇床
能够测量适合蛋白质测定的波长的吸光度的平板读数器（例如>，595 nm用于蛋白质测定）
电泳系统
免疫印迹系统
孵化器

软件

ImageJ（NIH）

程序

盖玻片涂层
1. 将6个盖玻片（直径32毫米）在70％乙醇中孵育5分钟，然后用蒸馏水冲洗。使用前盖玻片风干。
  注意：我们使用6个盖玻片进行ICAM-1Fc以获得与1 ml可溶性T细胞大致相同的蛋白质量（2 x 10 > 7 > 〜2 mg总蛋白质。）＆nbsp; >
2. 要涂覆盖玻片，将32 mm盖玻片置于6孔培养皿中，并在PBS中加入500μl5μg/ ml ICAM-1 Fc。在顶部添加第二个盖玻片。这种三明治减少了涂层所需的ICAM-1 Fc的量。
  注意：我们使用内部制造的ICAM-1Fc5μg/ ml，但也有市售的ICAM-1Fc。>
3. 在4°C孵育过夜。
4. 用镊子取下顶盖并翻转盖玻片，将两个盖玻片分开，使涂层面朝上，将盖玻片放在空的孔中。＆nbsp;
5. 通过在PBS中加入2ml 2.5％BSA并在室温（RT）下孵育1小时来阻断非特异性结合。
6. 用1ml PBS洗涤两次，用1ml HBSS洗涤一次。
7. 在添加细胞之前，加入1ml HBSS洗涤缓冲液（配方1）以保持盖玻片湿润。在添加细胞之前去除这种液体。
人原发性T淋巴细胞对ICAM-1的粘附＆nbsp;
1. 在HBSS洗涤缓冲液中洗涤8×10 7个 T淋巴细胞（参见注释），并在4℃下以300×g离心10分钟。
2. 在迁移缓冲液（配方2）中将细胞重悬成2×10 6个 / ml。
3. 将1ml细胞转移到微量离心管中进行未刺激的对照，然后在6孔板中每个ICAM-1包被的盖玻片的顶部转移1ml用于LFA-1活化样品。＆nbsp;
4. 将所有样品在37°C孵育20分钟。
5. 将微量离心管在300 x g >下在4℃下离心10分钟。
6. 用冰冷的PBS洗两次。
7. 小心地从微孔离心管中取出并丢弃悬浮液和上清液。
  重要事项：将平板和微量离心管一直放在冰上。>
8. 将微量离心管中的细胞沉淀重悬于含有蛋白酶抑制剂的500μl裂解缓冲液中，并在冰上孵育20分钟。将含有蛋白酶抑制剂的500μl裂解缓冲液加入到第一个孔中，用ICAM-1 Fc包被的盖玻片和上下移液管以溶解粘附的细胞，然后将悬浮液转移到相邻的孔中直至所有粘附的细胞都被裂解。将裂解液转移到新的微量离心管中，在冰上孵育20分钟。
  注意：从试剂盒中包含的5x裂解缓冲液中制备新鲜的裂解缓冲液，并加入蛋白酶抑制剂（1片/ 10 ml裂解缓冲液）。>
9. 通过在4℃下以14,000 x g >离心10分钟来清除裂解物。
10. 将上清液转移到新的微量离心管中并保持在冰上。
使用Bradford测定法测量蛋白质含量
1. 从每个样品中取2μl并加入58μlddH 2 O（1:30稀释）。
2. 混合并添加重复样品到96孔板（10μl/孔）。
3. 同时添加未稀释的BSA标准品（Bio-Rad，快速启动），一式两份。
4. 在ddH 2 O中稀释布拉德福德溶液1：5。
5. 每孔加入200μl稀释的Bradford溶液。
6. 在室温下孵育10分钟，保持黑暗。
7. 用读板器在595nm波长下测量吸光度。
8. 从获得的标准曲线计算蛋白质浓度。
9. 将裂解缓冲液中的样品稀释至完全相同的浓度，并从每个样品中取出50μl用于总细胞裂解液（TCL）。＆nbsp;
RhoB激活
注意：设置检测时，应包括阳性（GTPγS）和阴性对照（GDPγS），并遵循制造商的方案，并在此步骤中使用额外数量的细胞。>
1. 向微量离心管中加入等量的裂解液，用裂解缓冲液将每个样品的体积调节至1ml。
2. 通过涡旋或研磨彻底重悬试剂盒中包含的Rhotekin RBD琼脂糖珠浆液。
3. 快速向每个管中加入40μl重悬的珠浆。
4. 将管在4°C孵育1小时，同时轻轻搅拌。
5. 通过在14,000 x g >下离心10秒来沉淀珠子。
6. 吸出并丢弃上清液。
7. 每次用0.5ml裂解缓冲液洗涤珠子3次。
8. 小心取出上清液，将沉淀重悬于40μl2xSDS-PAGE样品缓冲液中。
9. 将每个样品在97℃下煮沸5分钟。
10. 将每个样品以14,000 x g >离心10秒。
注意：我们更喜欢将我们的样品保存在我们的手中，这对于RhoB抗体最有效。否则，您可以将样品冻结在-80°C，直到进入下一步。>
蛋白质印迹
1. 在8％聚丙烯酰胺凝胶上运行，不要忘记蛋白质总量的TCL。
  注意：我们在单独的凝胶上加载活性RhoB和TCL的下拉。由于RhoB抗体难以使用，因此包括RhoB免疫印迹阳性对照总是好的。我们在每个孔中加载20μl。>
2. 以90 V转换110分钟。
  注意：我们使用PVDF膜和PBS来检测所有抗体。如果您使用试剂盒中提供的RhoB抗体，请使用PVDF和TBS。 PVDF膜需要在转移前在100％甲醇中活化。>
3. 用PBS / 0.1％Tween 20冲洗。
4. 将膜在PBS / 0.1％吐温20中的5％奶粉中在室温下封闭2小时。
5. 用PBS / 0.1％Tween-20冲洗。
6. 与一抗孵育：
  具有下拉活性RhoB样品的膜用RhoB（1：500）和LFA-1（1：1,000）染色。含有TCL样品的膜在室温下用肌动蛋白（1：2,000），RhoB（1：500）和LFA-1（1：1,000）染色过夜。
  注意：>
  1. 我们使用来自Santa Cruz Biotechnology的RhoB多克隆抗体克隆sc-180（批次特异性）而不是试剂盒中包含的那个，因为克隆sc-180对于我们使用的原发性T淋巴母细胞效果更好。＆nbsp; >
  2. 为了能够检测LFA-1与活性RhoB的相互作用，我们在用下拉样品运行的膜上用总LFA-1（克隆m38）染色。我们使用内部生产的m38抗体。但是，同一克隆是可商购的。>
  3. 我们总是用肌动蛋白染色TCL进行上样对照，以及RhoB和LFA-1，以查看这些蛋白质的总量。>
7. 在PBS / 0.1％吐温20中洗涤3×5分钟。
8. 二抗孵育：抗兔-HRP（1：2,000）/抗小鼠-HRP（1：10,000）在室温下1小时。
9. 在PBS / 0.1％吐温20中洗涤3×10分钟。
10. ECL检测。

数据分析

从ECL-Western Blots扫描X射线胶片。
用ImageJ定量蛋白质条带密度。
1. 在每个波段周围绘制一个矩形感兴趣区域（ROI）并测量像素强度。
2. 在每个波段附近绘制相同大小的ROI并测量背景像素强度。
3. 计算背景校正的带强度。从原始集成密度（RawIntDen）带中，减去背景RawIntDen的引用值。

笔记

在该方案中，我们使用人原代T淋巴母细胞。当然，也可以使用其他细胞。有关原发性T淋巴细胞纯化程序，请参见Samuelsson 等人>（2017）。

食谱

HBSS洗涤缓冲液
没有Ca 2 + / Mg 2 + 的HBSS
10mM HEPES
迁移缓冲区
HBSS与Ca 2 + / Mg 2 +＆nbsp; 无酚红（Gibco）
5mM Mg 2 +
10 mM HEPES

致谢

我们要感谢Nancy Hogg博士（英国弗朗西斯克里克研究所）提供LFA-1抗体的礼物。该协议采自Samuelsson 等人>（2017）。这项工作得到瑞典研究委员会奖项K2010-80P-21592-01-4和K2010-80X-215917-01-4，基金会OlleEngvistBecggmästare，I＆amp; S的支持。 Lundberg研究基金会，瑞典皇家科学院，ÅkeWiberg基金会，Jeanssons基金会，Kocks基金会，P＆amp; U Schybergs基金会，Gyllenstiernska Krapperup基金会，Gustav V 80 Jubilee基金会，Österlund基金会，Nanna Svartz，Crafoord奖Anna-Greta Crafoord基金会和隆德皇家地理学会。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Cavalli，V.，Corti，M。和Gruenberg，J。（2001）。内吞作用和信号级联：近距离接触。 FEBS Lett > 498（2-3）：190-196。
Fernandez-Borja，M.，Janssen，L.，Verwoerd，D.，Hordijk，P。和Neefjes，J。（2005）。 RhoB通过Dia1促进内皮细胞膜上的肌动蛋白装配来调节内体转运。 J Cell Sci > 118（Pt 12）：2661-2670。
Samuelsson，M.，Potrzebowska，K.，Lehtonen，J.，Beech，J.P.，Skorova，E.，Uronen-Hansson，H。和Svensson，L。（2017）。 RhoB控制Rab11介导的LFA-1在迁移的T淋巴细胞中的再循环和表面再现。 Sci信号> 10（509）。