材料和试剂

移液器吸头
Pyrex硼硅酸盐玻璃管（Corning，目录号：99445-10 [10 x 75 mm]和99445-13 [13 x 100 mm]）
100纳米聚碳酸酯过滤器（Whatman，目录号：800309）
吸收和荧光比色皿（Hellma，吸收比色皿1 x 0.2，目录号：QS 104-10-40;荧光比色皿1 x 0.2，目录号：104002F-10-40;荧光比色皿1 x 0.4，目录号：104F-10 -40）
由教职员玻璃鼓风机设备手动制作的玻璃柱
Sephadex G-75（Pharmacia Biotech，目录号：17-0051-01）
氯仿（Scharlau，目录号：CL02001000）
甲醇（默克，目录号：106002）
Dimyristoylphosphatidylcholine（DMPC）（Avanti Polar Lipids，目录号：850345）
Dimyristoylphosphatidylglycerol（DMPG）（Avanti Polar Lipids，目录号：840445）
卵磷脂酰胆碱（PC）（Avanti Polar Lipids，目录号：840051）
蛋黄磷脂酰甘油（PG）（西格玛奥德里奇，目录号：50445）
氮气（Carburosmetálicos，目录号：UN1066）
Tris-Base（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
NaCl（默克，目录号：106404）
2-吗啉代乙磺酸一水合物缓冲物质MES（Merck，目录号：106126）
柠檬酸钠（默克，目录号：106448）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：03695）
N-（7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-基）二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（NBD-PE）（Avanti Polar Lipids，目录号：810143）
N-（lissaminerhodamine B磺酰基）二酰基磷脂酰乙醇胺（Rh-PE）（Avanti Polar Lipids，目录号：810157）
8-氨基萘-1,3,6-三磺酸（ANTS）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：A350）
对二甲苯双 - （吡啶鎓）溴化物（DPX）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：X1525）
液氮（法国液化空气公司）
Triton X-100（USB，目录号：22686）
四氢呋喃（Sigma-Aldrich，目录号：401757）
1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（DPH）（西格玛奥德里奇，目录号：D208000）
1-（4-三甲基氨基苯基）-6-苯基-1,3,5-己三烯（TMA-DPH）（Sigma-Aldrich，目录号：T0775）
中等缓冲液（见食谱）

设备

移液器：体积范围为2-20μl，20-200μl和200-1,000μl
Speed Vac（Uniequip，型号：Univapo 100 H）
水浴孵化器（Selecta，型号：unitronic 320）
Bath超声波仪（Bransonic，型号：Branson 1200）
挤出设备（Avestin，型号：LiposoFast TM -Basic）
分光光度计（Beckman Coulter，型号：Beckman DU-640）
荧光分析仪，配有恒温槽支架，其中比色杯的温度由循环水浴保持（SLM Aminco，型号：SLM Aminco 8000C）

程序

囊泡制备
1. 将脂质溶于氯仿/甲醇（2：1）中，浓度为10mg / ml。在13×100mm玻璃管中制备100μl的等分试样并在氮气流下干燥以获得脂质膜。将膜保持在真空中，在真空中保持6-8小时。
2. 在1ml适当pH值的培养基缓冲液中制备浓度为1mg / ml的磷脂悬浮液。
3. 在37℃下在水浴培养箱中孵育1小时，不摇动，每10分钟剧烈涡旋。
4. 在浴超声波仪中以40kHz的频率超声处理悬浮液10分钟，并使用100nm聚碳酸酯过滤器在挤出机设备中进行15个循环的挤出。对于成功的挤出过程，当将其插入注射器并小心缓慢地挤压注射器柱塞时，避免在脂质悬浮液中形成气泡。
  建议在进行实验前准备脂质囊泡，尽管它们可以在4°C下储存1-2天。
  囊泡制备后，根据Bartlett（1959）测定的磷含量计算确切的磷脂浓度。＆nbsp;
聚合研究
1. 添加不同量（在10和100μl之间）的15-20μME2 661 重组蛋白原液（参见Gómez-Gutiérrez et al。>，2018）将50μl最近制备的脂质囊泡和所需量的培养基缓冲液在适当的pH下达到总体积500μl。在10×75mm玻璃管中轻轻混合溶液后，最终的磷脂和蛋白质浓度必须分别为0.14mM和0.2-3.5μM。在不存在脂质的情况下，在不存在蛋白质和蛋白质的情况下使用脂质囊泡的对照。
2. 在37℃下在水浴培养箱中孵育1小时而不摇动。
3. 使用1×0.2cm吸收比色皿在分光光度计上测量360nm处的光密度（OD 360 ）。
脂质混合试验
注意：此协议改编自Struck > et al。> （1981）中描述的协议。由于脂质混合，该方法测量供体和掺入脂质体的受体之间荧光能量转移效率的降低。>
1. 制备两种不同类型的磷脂囊泡：（1a）标记的囊泡含有1mol％NBD-PE和0.6mol％Rh-PE和（1b）未标记的囊泡。标记的囊泡（1a）制备的实例如下：在单独的玻璃管中以1mg / ml的浓度溶解NBD-PE和Rh-PE在氯仿/甲醇（2：1）中的溶液;将10μl和6μl的NBD-PE和Rh-PE溶液与100μl未标记的磷脂在氯仿/甲醇（2：1）中的溶液以10mg / ml的浓度混合在玻璃管中并操作根据方法A，对于（1b），根据方法A直接操作。所有囊泡悬浮液在中等缓冲液中在适当的pH值下以1mg / ml的最终脂质浓度制备。
2. 将标记的（1a）和未标记的（1b）脂质体以1：9的摩尔比混合，保持最终的脂质浓度为1mg / ml，总体积为1ml。将该混合囊泡制剂稀释10倍（100μl+900μl培养基缓冲液）至终浓度0.14mM，用于脂质混合测定。
3. 在20mM Tris pH 7.5，NaCl 100mM中，从15-30μM储备溶液中添加不同量（5至100μl）的蛋白质。最终的蛋白质浓度必须在0.1-3μM的范围内。＆nbsp;
4. 在37℃下在水浴培养箱中孵育1小时而不摇动。
5. 在SLM Aminco 8000C荧光分光光度计中，在激发波长设定为450nm的1×0.4cm荧光比色皿中记录发射光谱（波长范围480-620nm）。将激发和发射狭缝设置为4 nm。为了使色散干扰最小化，分别使激发和发射偏振器保持恒定在90°和0°。
6. 使用530和590 nm处的发射强度的比率来计算FRET的效率（％FRET）以及适当的校准曲线。该曲线通过使用含有1mol％NBD-PE和可变浓度的Rh-PE（0,0.1,0.2,0.3,0.5,0.7,1和1.3mol％）的标记囊泡获得，根据下式：
  ％FRET = [1 - （F / F 0 ）] x 100
  
  在哪里，
  F是含有1％NBD-PE和0-1％Rh-PE的囊泡在530nm处的荧光强度。
  F 0 是含有1％NBD-PE和0％Rh-PE的囊泡在530nm处的荧光强度。
释放含水物质
注意：此协议改编自Ellens > 等> （1985）中描述的协议。该试验基于ANTS荧光的猝灭，该荧光是在释放含有ANTS和DPX的囊泡制剂的水性内容物时其稀释引起的。>
1. 荧光团ANTS和猝灭剂DPX必须分别以12.5和45mM的浓度共同包封在PG或PC磷脂囊泡中。为此目的，称取13.4mg ANTS和47.5mg DPX，并溶于2.5ml适当pH值的培养基缓冲液中。
2. 将2ml该溶液加入含有2mg适当磷脂的脂质膜（根据步骤A1制备）中。在不摇动的情况下在水浴培养箱中将膜在37℃下水合1小时，并在浴超声波仪中超声处理30分钟。
3. 使囊泡经历五次在液氮中冻融的循环。
4. 使用挤出机装置通过100nm聚碳酸酯过滤器（Avestin）将囊泡挤出至少15次。
5. 通过使用适当pH值的培养基缓冲液使样品通过Sephadex G-75柱进行洗脱，除去未包封的材料。通过将1g干燥的Sephadex G75在20ml培养基缓冲液中溶胀24小时来制备具有12-15ml床体积的典型柱。溶胀完成后，倾析上清液，加入缓冲液并使悬浮液脱气。为了包装，将完整的浆料倒入直径1-1.5厘米的玻璃柱中。以1ml / min的流速进行色谱分离，收集1ml级分。包封的材料以高浊度的级分在空隙体积中洗脱，因此通过在分光光度计中测量每个级分在360nm处的光密度来检测，而未包封的游离染料在柱体积中洗脱。在0.14mM的测定中将包封的囊泡稀释至最终的磷脂浓度。
6. 向0.8ml稀释的磷脂囊泡悬浮液中加入不同量的E2 661 重组蛋白的储备溶液（15-20μM）。最终的蛋白质浓度必须在0.1-3μM的范围内。＆nbsp;
7. 使用1×0.4cm荧光比色杯记录在375℃恒温细胞保持器中在385nm激发时520nm处荧光发射的增加。将激发和发射狭缝设置为4 nm。为了使色散干扰最小化，分别使激发和发射偏振器保持恒定在90°和0°。
8. 通过向0.8ml稀释的磷脂囊泡悬浮液中加入40μl10％Triton X-100（终浓度：0.5％Triton）将荧光标度设定为100％，并通过测量0.8ml对照的荧光将其设定为0％稀释的磷脂囊泡。对于每种蛋白质浓度，参数％F max 根据以下等式计算：
  
  ％F max = [（F prot - F 0 ）/（F max - F 0 ）] x 100
  
  在哪里，
  - F prot 是加入E2蛋白后520nm处的荧光强度。
  - 在加入蛋白质（0％）之前，F 0 是520nm处的初始荧光强度。
  - F max 是加入Triton X-100（100％）后520nm处的荧光强度。
荧光偏振测量
1. 制备用荧光探针DPH或TMA-DPH标记的DMPG或DMPC磷脂囊泡。对于DPH，探针/磷脂重量比为1：500，对于TMA-DPH，探针/磷脂重量比为1：100。标记的囊泡制备的实例如下：使用两个玻璃管将DPH溶解在四氢呋喃中，并将TMA-DPH溶解在甲醇中;浓度为1毫克/毫升;在玻璃管中混合2μlDPH（或10μlTMA-DPH）溶液与100μl合成磷脂（DMPG或DMPC）在氯仿/甲醇（2：1）中的浓度为10 mg / ml的溶液根据方法A操作。所有囊泡悬浮液在中等缓冲液中在适当的pH值下以1mg / ml的最终脂质浓度制备。
2. 在不存在或存在E2 661 重组蛋白的情况下，在水浴培养箱中37℃孵育标记的囊泡，不振摇，最终脂质浓度为0.14 mM，蛋白质/脂质摩尔比1：20,1：50或1：100例如，对于总体积为400μl，移取40μl标记的囊泡悬浮液，20-100μl的28μME2蛋白的储备溶液，以及在适当的pH下所需量的培养基缓冲液以达到总体积400μl。孵育后，将样品冷却至10ºC。
3. 将荧光分光光度计的激发和发射狭缝宽度调整为4 nm。
4. 将激发波长设定在365nm，并在样品在所需温度下平衡10分钟后测量425nm处的发射。将1×0.2cm荧光比色皿中的温度保持在具有循环水浴的恒温槽容器中。荧光偏振值由装置直接提供，并使用荧光分光光度计软件根据以下等式计算：
  
  P（极化）=（I VV - I VH ）/（I VV + I VH ）
  
  其中，I VV 和I VH 分别是当垂直取向的激发偏振器激发样品时的垂直和水平荧光强度。

数据分析

聚合研究
通过测量由于磷脂悬浮液的散射导致的360nm处光密度（OD 360 ）的增加，研究了E2 661 诱导脂质体聚集的能力。在pH 5.0和pH 7.0下，对于不同磷脂/蛋白质比例的PC和PG囊泡获得的结果如图1所示。这些过程的初始速率分析表明聚集几乎是瞬时的。在所有情况下，OD 360 值取决于E2 661 浓度，并随着蛋白质浓度的增加而变得饱和。

图1.不同浓度的E2 661 诱导的PC（ - - ）和PG（ - ）磷脂囊泡的聚集。在pH7.0（▲）和pH 5.0的培养基缓冲液中于37℃孵育1小时的囊泡（0.14 mM）后，测量360 nm处的光密度（OD 360 ）（●）含有不同浓度的蛋白质等分试样。最终的磷脂浓度为0.14mM。显示的结果是三次独立实验的平均值和标准差。
脂质混合试验
脂质混合之后是荧光探针NBD-PE和Rh-PE之间的共振能量转移（FRET）测定（Struck et al。>，1981）。在图2中描绘了用PG在pH 7.0和5.0以及PC囊泡在pH 5.0下获得的结果。这些结果表明E2 661 能够诱导标记和未标记囊泡的相当多的融合。在PC囊泡的情况下，在pH 5.0下未观察到能量转移的减少。因此，脂质混合特异性地由E2糖蛋白在含有具有酸性头基的脂质的囊泡上以几乎不依赖pH的方式诱导，并且在靶脂质体上不存在受体时发生。

图2.由E2诱导的脂质混合 661 。含有供体和受体分子的囊泡与未标记的混合以1：9（摩尔：摩尔）的比例。将增加浓度的E2 661 加入混合物中。 NBD-PE和Rh-PE的浓度分别为1mol％和0.6mol％。 PG（●，▲）或PC（■）囊泡在pH7.0（●）和5.0（■，▲）的培养基缓冲液中水合。最终的磷脂浓度为0.14mM。显示的结果是三次独立实验的平均值和标准差。
释放含水量
引起磷脂囊泡水性内容物释放的能力也用于检查E2 661 的去稳定性质。通过共同包封的荧光团ANTS及其碰撞猝灭剂DPX的稀释来监测脂质体渗漏，这导致520nm处ANTS荧光的快速增加（Ellens 等，>，1985）。在测试的两个pH值下加入PG或PC磷脂悬浮液中的蛋白质引起的渗漏如图3所示。在中性磷脂囊泡上诱导的这一过程低于PG囊泡观察到的过程，表明静电成分对蛋白质的重要性。 - 脂质相互作用。

图3.由E2诱导的ANTS / DPX泄漏 661 。增加浓度的E2肽被添加到囊泡中在pH7.0（■）和5.0（●）的培养基缓冲液中加载ANTS和DPX的PC（ - - ）和PG（ - ）磷脂囊泡。通过添加蛋白质引发泄漏，并且连续记录在385nm激发时在520nm处的荧光发射的增加。加入0.5％Triton X-100后得到 F > max > 。测量在37℃下进行，测定中的最终磷脂浓度为0.14mM。显示的结果是三次独立实验的平均值和标准差。
荧光偏振测量
E2胞外域能够与磷脂囊泡相互作用，改变其热致行为。这通过测量结合到磷脂囊泡中的荧光探针DPH的荧光去极化来证明。该分子提供了与蛋白质相互作用如何改变酰基链更深环境的线索（Lentz et al。>，1976; Prendergast et al。>，1981）（图） 4）。

图4. E2 661 对DPH标记的DMPG（A，B）和DMPC的荧光偏振温度依赖性的影响（C，D）在pH5.0（A，C）和7.0（B，D）脂质体中。蛋白质：脂质摩尔比为：（●）0.0（无蛋白质），（◆）1：100，（■）1：50，（▲）1:20。显示的结果是三次独立实验的平均值和标准偏差。

食谱

中等缓冲区
Tris-HCl 5 mM
NaCl 100 mM
MES 5 mM
柠檬酸钠5 mM
EDTA 1 mM

致谢

这项工作得到了西班牙MinisteriodeEducaciónyCiencia的资助BFU 2006-13033和SANTANDER / COMPLUTENSE PR26 / 16-20271研究项目的支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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