材料和试剂

无菌移液器吸头
无菌18毫米玻璃管（Fisher Scientific，目录号：S63300）
无菌13毫米玻璃管（Fisher Scientific，目录号：14-961-27）
无菌不锈钢瓶盖（18毫米颈部尺寸）（VWR，目录号：71000-330）
无菌不锈钢瓶盖（13毫米颈部尺寸）（VWR，目录号：71000-322）
无菌1.7毫升微量离心管（Denville Scientific，目录号：C2170）
无菌60毫升Luer Lock注射器（Fisher Scientific）
无菌Acrodisc ® 13 mm注射器过滤器（0.2μm孔径）（VWR，目录号：28142-340）
无菌注射器滤盘（孔径0.2μm）（VWR，目录号：28145-477）
1.5毫升Cuvettes（Dot Scientific，目录号：2410）
铝箔
100 x 15 mm培养皿（Crystalgen，目录号：S-3006）
无菌玻璃珠（直径0.2-0.3 mm）（Sigma-Aldrich，目录号：G1277）
无菌条纹棒（扁牙签）（VWR，目录号：500029-808）
Bacillus subtilis >（ B. subtilis >）
注意：这包括对照菌株和测试菌株。对于对照菌株，> B. subtilis > subsp。枯草芽孢杆菌168或> B. subtilis > str。通常使用PY79。>
LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3022-1KG）
LB琼脂（VWR，Difco TM ，目录号：90003-346）
NaCl（Dot Scientific Inc.，目录号：7647-14-5）
KCl（RPI，目录号：P41025-500.0）
Na 2 HPO 4 （J.T.Baker，目录号：7558-79-4）
KH 2 PO 4 （VWR，目录号：7778-77-0）
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：221465-500G）
K 2 HPO 4 （Dot Scientific Inc.，目录号：DSP41300-1000）
葡萄糖（Amresco Inc.，目录号：50-99-7）
柠檬酸钠二水合物（Na 3 C 6 O 7 •2H 2 O）（VWR，SX00445-1 EMD））
酪蛋白水解物（EMD，目录号：1.02245.0500）
谷氨酸钾一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：G1501-100G）
100 ng /μl基因组DNA与选择标记
注意：供体DNA上的标记不应存在于任何被测试的菌株中。>
MgSO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
柠檬酸铁铵（J.T. Baker，目录号：1185-57-5）
抗生素（供选择）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
10x能力培养基（MC）（见食谱）
1 M MgSO 4 （见食谱）
1,000x铁柠檬酸铵（见食谱）

设备

移液器
带有圆盘的滚筒用于18毫米管（新不伦瑞克，TC-7型电机带盘，适用于18毫米管）
注意：如果没有18毫米管的圆盘，可以使用16毫米管的圆盘。在18 mm管装置中可以使用16 mm管替换13 mm管（图1）。>
Vortexer（VWR，目录号：58816-121）
37°C培养箱与架子
微量离心机能够达到6,200 x g >
紫外/可见光谱仪（Thermo Fisher Scientific，型号：4001/4）
高压灭菌器

程序

准备培养物的准备
1. 需要条纹 B。在适当的情况下，将枯草芽孢杆菌细胞置于LB琼脂上，并使用选择性抗生素。
2. 将板在37℃孵育过夜或室温放置2-3天。
3. 在置于18mm玻璃管内的13mm玻璃管中，接种1ml含有 B单菌落的LB培养物。枯草芽孢杆菌>在开始预培养前约12小时，并在室温下培养细胞过夜（图1）。
  注意：此设置有助于转移液体培养物，因为有些移液器可能无法到达18 mm玻璃管的底部。>
  
  图1.在18 mm管内安装13 mm管的两种可能方法。在设置1中，将1 ml移液器吸头的末端切断并插入18 mm管中，将13 mm管设置在吸头顶部。在装置2中，两个13毫米玻璃管帽彼此叠置并放入18毫米管的底部。
转化分析设置
1. 将细胞在37°C下生长一小时。
  注意：滚筒应设置为9 RPM。>
2. 将1ml每种培养物转移到1.7ml微量离心管中。
3. 通过离心（6,200 x g >; 2分钟，室温）收获细胞。微量离心管底部应该有一个可见的颗粒。
4. 用移液管移除上清液并丢弃。
5. 将细胞重悬于1ml 1x PBS中。
6. 再次离心（6,200 x g >; 2分钟，室温）。
7. 用移液管移除上清液并丢弃。
8. 将细胞重悬于1ml 1x PBS中。
9. 再次离心（6,200 x g >; 2分钟，室温）。
10. 弃去上清液并将细胞重悬于500μl新制的1x MC中（参见食谱）。
11. 检查OD 600 ，使用150μl重悬细胞和450μl1xPBS（空白，150μl1xMC和450μl1xPBS）
  注意：OD > 600 > 应为0.2-1.2。>
12. 将洗过的细胞接种到18mm管中的新的13mm管中，并填充到1ml的1x MC中，因此培养物的起始OD 600 为0.01至0.05。
  注意：可添加1μl与原始菌株抗性相关的选择性抗生素（不是供体DNA抗生素标记物），以防止任何意外污染。>
13. 在37°C下滚动4.5至5小时，培养细胞。
14. 4.5至5小时后，将300μl每种培养物转移至新的13mm玻璃管中。
15. 向每个培养管中加入3μl基因组DNA（浓度为100 ng /μl）和3μl1MMgSO 4 。
  注意：包括一种没有添加DNA的培养物作为每个实验的对照。>
16. 继续在37°C下滚动细胞2小时。
连续稀释和电镀
1. 从37°C回收培养物。
2. 在1x PBS中产生1:10系列稀释的培养物至10 -6 稀释液。
3. 使用玻璃珠将100μl所需稀释液加到LB（用于CFU）和选择性板（用于TFU）上（图2）。
  注意：10 - > 6 > 稀释液应为野生型TFU产生30-300个菌落。对于突变体，稀释平板取决于存在的缺陷类型，因此需要进行初步实验以确定电镀所需的稀释范围。>
  
  图2.比较野生型细胞与突变体时电镀的外观。在第1行中，野生型和Δ lacA >菌株以10 -2 稀释度接种。 Δ comK >和Δ ecsB >菌株接种未稀释的培养物。第1行中的所有平板都含有与供体DNA上存在的标记相关的可选抗生素。将第2行接种在具有10 -6 稀释液的LB平板上。每列是不同的基因型。第1列是野生型，第2列是Δ comK >（转化所需的基因），第3列是Δ lacA >（与自然转化无关的基因），第3列4是Δ ecsB >（推定参与自然转化）。在未稀释的Δ comK >选择性平板上没有形成菌落，在Δ ecsB >选择性平板上可见一些菌落，并且菌落形成处于野生型水平Δ LACA >。在此步骤中，CFU也可以与野生型进行比较。
4. 将板置于37℃过夜，或在室温下放置2-3天。
  注意：由于选择，TFU平板可能需要额外的一天才能使菌落生长。>
5. 在每个盘子上计数菌落。每个平板上的菌落必须乘以稀释系数才能获得CFU和TFU。
  注意：使用标记来计算菌落可能会有所帮助，同时使用计数器来跟踪菌落数。>

数据分析

每个菌株至少进行三次定量转化效率测定，每次重复每次稀释。在每次重复过程中也应实施阳性对照（野生型菌株）和阴性对照（不添加供体DNA的野生型）。
注意：每个重复使用来自同一平板的不同菌落进行。>
对于数据分析，使用公式ηS> = Cr > /（ C > T > <计算转换效率/ sub> pD >），其中 C > r > 是TFU（转化体）的平均数， C > T > 是CFU的平均总数， pD >是生物学重复中每毫升微克的DNA浓度。将每个重复标准化为WT并同时运行。测定的检测限为0.5个转化体/ CFU /μg基因组DNA（如Chilton 等人，2017;对于PY79，具有用100μg/ ml壮观霉素选择的转化DNA）。
对于统计分析，相对效率值用以下等式转换为arcsin值，以允许Dunnett多重比较测试的正态分布输入（用于比较所有突变体和对照）：D S = [180 sin -1 （η S > / 6）] /π。 Dunnett的多重比较测试是使用R统计分析软件中的multcomp软件包对转换后的数据进行的。对WT和突变体的相对转化效率进行对数转换以产生正态分布的数据，并且 t > - 将每个突变体成对地与相应的对照进行比较的试验用于测试显着差异（如在Chilton 等中。>，2017）。
注意：当针对WT测试单一菌株时，可以使用ANOVA或t检验。>

食谱

10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（0.5L，pH7.4）
40克NaCl
1克KCl
7.26g Na 2 HPO 4 （无水）
1.2克KH 2 PO 4
ddH 2 O至0.4 L
溶解固体
用50％NaOH将pH调节至pH 7.4 用ddH 2 O使总体积达到0.5L 通过高压灭菌灭菌
在室温下储存
在ddH 2 O中稀释1:10以获得1x PBS
注意：与dH相比，ddH > 2 > O提供批次之间的一致性> 2 0 >
10x能力培养基（MC）（100 ml）（如Konkol et al。>，2013）
10.7g K 2 HPO 4
5.2克KH 2 PO 4
20克无水葡萄糖（葡萄糖）
0.88g Na 3 C 6 O 7 •2H 2 O（柠檬酸钠二水合物）
1毫升1,000倍铁柠檬酸铵（2.2％库存）（见下文）
1克酪蛋白水解物EDM
2.2克谷氨酸钾一水合物
ddH 2 O至100毫升
彻底混合;使用0.2μm过滤器和注射器过滤消毒
储存在-20°C
注意：要制备1 ml新鲜的1x MC，将100μl10xMC稀释到900μlddH> 2 > O中。一旦获得1ml的最终浓度，加入3μl1MMgSO 4 > >
1 M MgSO 4 （0.5 L）
60g MgSO 4 （无水硫酸镁）
ddH 2 O至0.5 L
通过高压灭菌灭菌
在室温下储存
1,000x柠檬酸铁铵（100 ml）
2.2克柠檬酸铁铵
ddH 2 O至100毫升
使用螺旋盖过滤器过滤消毒
用铝箔包裹
在室温下储存
注意：此解决方案对光敏感。>

致谢

该协议改编自Chilton et al。>（2017）。这项工作的部分资金来自丽塔艾伦基金会的资助。

利益争夺

作者在这项工作中没有利益冲突或利益冲突。

参考

Anagnostopoulos，C。和Spizizen，J。（1961）。 Bacillus subtilis >的转化要求。 J Bacteriol > 81（5）：741-746。
Chilton，S。S.，Falbel，T.G。，Hromada，S。和Burton，B。M.（2017）。枯草芽孢杆菌>能力蛋白ComFA中的保守金属结合基序增强转化。 J Bacteriol > 199（15）：e00272-17。
Cutting，S.M。和Vander Horn，P.B。（1990）。遗传分析。在：Harwood，C.R。和Cutting，S。M.（编辑）。芽孢杆菌的分子生物学方法。> John Wiley＆amp; Sons，Ltd.，West Sussex，UK。第27-74页。
Dubnau，D。和Davidoff-Abelson，R。（1971）。主管 Bacillus subtilis >吸收后转化DNA的命运。 I.供体 - 受体复合物的形成和性质。 J Mol Biol > 56（2）：209-221。
Konkol，M。A.，Blair，K。M。和Kearns，D。B.（2013）。质粒编码的ComI抑制枯草芽孢杆菌>祖先3610株的能力。 J Bacteriol > 195（18）：4085-4093。