材料和试剂

注射器1毫升（BD Plastikpak，目录号：303172）
离心管50 ml，锥形底（Greiner Bio One，目录号：210261）
塑料移液器25 ml（Greiner Bio One，目录号：760180）
显微镜载玻片（Thermo Scientific，Menzel-Glazer，目录号：631-0098）
盖玻片，24 x 60 mm（Thermo Scientific，Menzel-Glazer，目录号：15747592）
方形板，120 mm（Greiner Bio One，目录号：688102）
培养皿，94毫米（Greiner Bio One，目录号：632102）
非无菌手术刀刀片，21号弯曲切削刃（Swann-Morton，目录号：0107）
铝箔，薄
玻璃巴斯德吸管（长）（WU Mainz，目录号：10216234）
钢网80（177μm）（细胞培养试剂）（Sigma，目录号：S3770）
5毫升聚丙烯圆底管（猎鹰，目录号：352063）
膜过滤器，孔径0.45μm（Millipore，Milex-HV，目录号：SLHV033RS）
Edding 400永久性标记，1 mm圆点（Edding）
电子。大肠杆菌（DH5α）
农杆菌（GV3101）
Nicotiana benthamiana
pZK538载体（Addgene，目录编号：118012）
pDGB3alpha2_35S：P19：Tnos（GB1203）（p19）（Addgene，目录号：68214）
Avr2-GFP pZK538（Addgene，目录号：118011）（Cao et al。，2018）
NSm pZK538（Addgene，目录号：118011-13）（Feng et al。，2016）
Phusion聚合酶
DMSO
Gamborg B5培养基（Duchefa，目录号：G0209）
MES钠盐（Duchefa，目录号：M1503）
氯化钙二水合物（CaCl 2 •2H 2 O）（默克，目录号：102382）
硝酸铵（NH 4 NO 3 ）（默克，目录号：101187）
蔗糖（Duchefa，目录号：S0809）
Macerozyme R-10（Duchefa，目录号：M8002）
纤维素酶onozuka RS（Duchefa，目录号：C8003）
乙醇（96％）（VRW化学品，目录号：83804）
商业漂白剂（<5％次氯酸盐）
无菌MilliQ水
氢氧化钾（KOH）（默克，目录号：105033）
DpnI限制酶（Thermo Scientific，目录号：ER1701）
GeneJet PCR纯化试剂盒（Thermo Scientific，目录号：K0702）
GeneJet凝胶提取试剂盒（Thermo Scientific，目录号：K0692）
NEBuilder Hifi DNA组装克隆试剂盒（NEB，目录号：E5520S）
琼脂糖（Sphaero Q，目录号：s103a）
MS基础盐混合物（Duchefa，目录号：M0221）
乙酰丁香酮（C 10 H 12 O 10 ）（默克，目录号：D134406）
TEX缓冲区（见食谱）
叶消化液（见食谱）
MMAi中（见食谱）

设备

手术刀架
规模
刻录机＆NBSP;
流罩
钳子
移液器
叶片打孔机5 mm（Well Tech，Rapid core，目录号：E69039-50）
共聚焦显微镜LSM 510（蔡司，型号：LSM510）
EVOS FL细胞成像系统（Thermo Fisher，型号：EVOS FL，目录号：AMF4300）
血细胞计数器0.100毫米; 0.0025 m 2 （Merck，Blaubrand，目录号：BR719520）
Rotina 420R离心机（Hettich Zentrifugen，型号：Rotina 420R，目录号：4701）
PCR机（Bio metra，TAdvanced）
凝胶电泳机（Bio-Rad）
Pipetus移液泵（Hirschmann Laborgerate，Pipetus，目录号：9907200）
加热块（Grant Instruments，型号：QBD2，目录号：11470958）
FACS Aria III BD（BD Biosciences，型号：FACS Aria III）

软件

Kaluza流式细胞分析软件1.2版（Beckman Coulter，US）
斐济（斐济只是ImageJ）版本1（ https://fiji.sc/ ）（Schindelin et al 。，2012）

程序

构建一代
1. 使用Phusion聚合酶和引物组FP7939（GGC TAT CGT TCG TAA ATG GTG）和FP7940（GGA TCC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GT）使用反转PCR线性化pZK538载体（Addgene＃118012）。
  注意：在标准Phusion PCR混合物中加入3％DMSO，总体积为20μl。
2. 使用以下PCR程序：
  1. 98°C 30秒
  2. 98°C 10秒
  3. 57°C 30秒
  4. 72°C 15分钟
  5. 重复步骤b-d 30次
  6. 72°C 10分钟
    注意：15个循环后，在反应中加入额外的0.1μlPhusion。
3. 用DpnI限制酶消化线性化PCR产物以除去原始模板。
4. 用GeneJet PCR纯化试剂盒清洗消化的PCR产物。
5. 在1％琼脂糖凝胶上电泳1μl线性化的pZK538载体用于大小和浓度估计。
6. 设计引物以扩增您感兴趣的基因[HiFi DNA装配克隆方案（NEB）]：
  Fw入门：＆nbsp; CACCATTTACGAACGATAGCC ATGCCTGTGGAAGATGCCGATTC
  Rv引物： ACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGG ATCCATCCTCTGAGATAGTAAGAGAGAGAG
  注意：用感兴趣的基因特定序列替换带下划线的部分。去除反向引物的终止密码子，因为GFP将在C末端融合。
7. 使用Phusion聚合酶PCR（标准Phusion PCR混合物，总体积为20μl）扩增您感兴趣的MP和非MP。
8. 将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离，并使用GeneJet凝胶提取试剂盒分离该片段。＆nbsp;
9. 通过在1％琼脂糖凝胶上加载1μl来估计DNA浓度。
10. 根据HiFi DNA装配克隆方案（NEB），将您感兴趣的基因克隆到线性化的细胞 - 细胞运动载体pZK538中。＆nbsp;
11. 使用以下反应混合物（载体：插入比例1：2）：
  100ng线性化的pZK538载体（14kb）
  7 ng MP /非MP插入物（500 bp）
  10μlNEBuilderHiFi DNA Assembly Master Mix
  用MilliQ水填充高达20μl
  注意：根据碱基对（bp）的大小调整插入DNA的量。
12. 将反应混合物在50℃下在加热块中孵育45分钟。
13. 将2μl反应混合物转化为 E.大肠杆菌（DH5α）（Green和Sambrook，2012）。
14. 通过对插入序列进行测序来检查您的最终构建体（FP7939：CACCATTTACGAACGATAGCC ATGCCTGTGGAAGATGCCGATTC ）。
  注意：用感兴趣的基因特定序列替换带下划线的部分。
15. 如果正确，继续使用电穿孔法将25 ng的最终构建体转化为 Agrobacterium （GV3101）（1.25 kV，
  25μF，400Ω）（Mersereau et al。，1990）。
Nicotiana benthamiana 植物生长和农杆菌渗入＆nbsp;
1. 根据Ma et al。，2012描述的方案种植植物。
  注意：在生长室而不是温室中种植植物可以提供质量更好的原生质体。
2. 简而言之：在生长室中发芽10-15粒种子（22.0℃，70％湿度，短日照：13小时黑暗; 11小时光照）并在播种后7天将幼苗转移到分开的10cm盆中。＆nbsp;
3. 当植物长达五周时，继续进行农杆菌渗入，这个阶段最适合农杆菌渗入（Ma et al。，2012），并且为后来的原生质体分离提供了相当大的叶片。
  注意：从植物顶部开始计数，使用第二，第三和第四叶进行渗透（参见Ma 等人的图4 ，2012）。＆NBSP;
4. 使用Ma 等，2012所述的农杆菌渗入方案（但使用不同的OD 600 细菌滴度，见下文）。＆nbsp;
5. 在农杆菌渗入之前将农杆菌在MMAi培养基（参见配方）中孵育至少2小时。
6. 尝试一系列不同的细菌滴度（例如，OD 600 0.5,0.1,0.05 等）以确定马赛克的最佳浓度你的MP和非MP的转型模式。作为对照（非MP），可以使用Avr2-GFP。在我们的手中，最终OD 600 0.05最适合用于Avr2-GFP（图3）。 Six5和GUS可以在OD 600 0.5时渗透。
  注意：如果遇到低强度的GFP信号，使用OD 可以共同渗透沉默抑制因子p19（见类似构建体的Addgene＃68214）（渗入前混合培养物） 600 0.5。＆nbsp;
7. 渗入一半叶（直到主脉），用另一半的MP-GFP和非MP-GFP，用Edding 400永久性标记（1 mm）标记渗透的部分。
8. 用共聚焦显微镜（参见方法C）渗透后72小时分析转化区域的叶盘。
  注意：时间可能因目标蛋白质的表达水平而异。在我们的设置成像中，渗透后72小时产生最高的荧光水平。
使用共聚焦显微镜成像细胞间移动
1. 用5毫米叶片打孔机打入渗透区域的叶片盘，并将底面朝上放在显微镜载玻片上。在样品顶部放置一个盖玻片（24 x 60 mm）。通过在叶盘周围添加MilliQ水来防止样品脱水。＆nbsp;
2. 设置共焦显微镜LSM 510：对于GFP激发，使用Ar离子激光器在488nm激发并记录505-550nm的发射。对于mCherry激发，使用氩-2激光在568nm激发并记录在585-615nm的发射。对于GFP和mCherry，使用14％的激光强度和1个通风单位的针孔。
3. 选择托盘选项卡并使用范围指示器微调荧光图像设置。通过改变探测器增益和放大器偏移，调整GFP和mCherry信号的最大和最小强度。＆nbsp;
4. 如果观察到适当的GFP和mCherry荧光信号，则继续寻找mCherry通道中被4至5mCherry荧光细胞包围的“间隙”（2至3个未转化的非荧光细胞）。如果在mCherry通道的非荧光区域发生细胞间移动，它将在GFP通道中显示GFP信号（图3.底部面板）。与周围的转化细胞相比，这种移动GFP信号可能相对较弱，但可以通过其清洁和特异性定位于细胞核和细胞质来区别于非特异性背景信号（图3.底部图）。
  注意：理想情况下，大多数细胞将被转化，导致汇合的荧光周围偶尔出现间隙。增加手中的间隙数会导致信号强度降低。
  
  图3.马赛克样转化模式显示Avr2-GFP的细胞间移动。携带pZK538载体的农杆菌菌株的共农杆菌过滤，该载体包含编码mCherry-HDEL和Avr2-GFP的基因，携带含有SIX5或GUS的 Agrobacterium 菌株二进制到 N.本生的叶子。转化细胞显示红色ER定位信号和绿色Avr2-GFP信号定位于细胞质和细胞核（由星号表示）。 ER定位的mCherry不能移动到邻近的未转化细胞并且用作转化标记物。在不存在Six5（非移动Avr2-GFP）的情况下，在与转化细胞相邻的未转化细胞中未观察到红色或绿色荧光（上图）。在存在Six5（移动Avr2-GFP）的情况下，位于转化细胞侧翼的未转化细胞在细胞质中偶尔在细胞核中显示绿色荧光，表明Avr2-GFP的细胞 - 细胞易位（由箭头，下图表示）。上图改编自Cao 等人（2018）。比例尺=35μm。
原生质体隔离
1. 我们的原生质体分离方案基于Faraco 等人（2011）描述的方法，稍作修改（图4）。
2. 收集渗入的叶子并包括未渗透的模拟对照（用于渗透的植物之一的第二，第三或第四叶）。
  注意：一次收获一片叶子，以防止样品制备过程中其他叶片萎..
注意：在流量计中执行以下所有步骤。 TEX缓冲液很容易被污染，导致死亡的原生质体。
1. 准备五个烧杯，一个装有250毫升70％乙醇，一个装有100毫升1％次氯酸盐溶液（5倍稀释的市售漂白剂显示相当），三个装有250毫升无菌MilliQ水。还通过向5ml叶消化溶液等分试样（10x）中加入45ml TEX缓冲液制备叶消化溶液（预先制备，参见配方）。
  注意：一片叶子消化液等分试样适用于五个样品，每个样品10毫升。在上述准备过程中，为实验解冻适当数量的等分试样。
2. 通过将叶子中的每一个浸入70％乙醇中几秒钟并将其浸入1％次氯酸盐溶液中30秒来对叶子（一次一个）进行灭菌。接下来，通过浸入无菌H 2 O中将叶子冲洗三次。
  注意：用茎上的无菌镊子抓住叶子，以免撕裂叶子。
3. 将灭菌的叶子放入无菌的方形培养皿中，并使用无菌手术刀沿着标记切割渗透的叶子区域。
4. 将叶半放入含有2ml叶消化溶液（1x）的无菌圆形培养皿中。使用锋利的手术刀将叶片切成2-5毫米的条带。
  注意：使用无菌镊子轻轻地将叶片固定到位并定期更换手术刀片。
5. 在叶条上加入8毫升叶子消化液，确保将每个条带轻轻地推入下面。
6. 关闭培养皿并用铝箔包裹。
7. 将板在室温下孵育过夜（约15小时）而不摇动。
8. 第二天早上，在流动罩中打开盘子。
  注意：正确消化的叶条看起来几乎是透明的。绿色原生质体应该漂浮在培养基中。＆nbsp;
9. 使用无菌镊子去除所有叶条并轻轻地在溶液中上下移动以释放剩余的原生质体。＆nbsp;
10. 通过在气体燃烧器中加热手术刀刀片几秒钟，在培养皿中创建一个V形开口，并用它在培养皿侧面做一个小切口。切割时略微将刀片转向一侧以形成V形。这个开口可用于倒入原生质体悬浮液。
11. 将高压灭菌的钢网80（177μm）置于干净的无菌培养皿上，并用少量TEX缓冲液润湿网。使用V形开口轻轻地将原生质体溶液倒入网中。向原始培养皿中加入约5ml TEX缓冲液以收集剩余的原生质体，并将它们通过筛网倒入新的培养皿中。在这个新的培养皿中创建另一个V形开口。
12. 通过V形开口将原生质体溶液倒入50ml Greiner管中，用TEX缓冲液将体积调节至25ml。
  注意：将45毫升Greiner管保持在45°角，以保持温和的流动，防止对原生质体的剪切力。
13. 在室温下使用Rotina 420R离心机在100 x g 下旋转10分钟，加速2和减速度为0.
  注意：检索样品时要小心，活的原生质体会在顶部形成一个环并且很脆弱！
14. 使用连接到Pipetus移液泵的长灭菌巴斯德移液器来移除缓冲液和尽可能多的碎片。
  注意：在清除碎屑时以及液体到达底部时减慢泵的速度，以避免丢失漂浮的原生质体细胞。
15. 将原生质体悬浮液重悬于25ml TEX缓冲液中。
  注意：将45毫升Greiner管保持45°角，以避免剪切。
16. 再次重复洗涤步骤（D15-D16）。
17. 在第二次旋转后，将原生质体悬浮液重悬于约3-4ml TEX缓冲液中。
18. 使用血细胞计数器通过明视野显微镜计数细胞，确定原生质体的质量（完整;圆形细胞）和浓度。浓度 ca。 3 x 10 7 细胞/ ml就足够了。＆nbsp;
19. 继续进行原生质体样品的流式细胞术分析。
  
  图4.原生质体分离方法。显示了原生质体分离的流程图。一个 N.在原生质体分离（浅蓝色）之前72小时，用含有土壤杆菌菌株的MP-GFP和非MP-GFP构建体渗入本塞姆氏叶。将渗入的叶片切成叶条，在叶消化溶液中消化过夜，并在网（蓝色，顶板）上过滤。将分离的原生质体离心（100 x g ）以沉淀碎片。然后通过除去碎片和大部分缓冲液洗涤原生质体，并重新悬浮在新鲜的TEX缓冲液中。离心并除去缓冲液后，原生质体在剩余的几毫升浓缩（蓝色，下图）。使用明场或荧光显微镜检查原生质体的质量（完整;圆形细胞）和荧光。随后，通过使用血细胞计数器（黄色）计数细胞来估计原生质体悬浮液的浓度。
流式细胞仪
1. 将500μl原生质体悬浮液和500μlTEX缓冲液混合，并用50μm过滤器吸移到5ml聚丙烯圆底管中。
2. 将管放入FACSAria III（BD Biosciences，US）装载室中，并通过机器装载样品。
3. 使用以下激光设置记录红色和绿色通道：488 nm处的GFP激发和530/30 nm处的发射捕获。 mCherry激发在561nm处，发射捕获在610/20nm处。
4. 调整红色和绿色通道的电压，以扩大人口规模。
5. 每个样品计数50,000个细胞，使用中性密度滤光片2.0以保持前向散射（FSC）原生质体的规模。＆nbsp;

数据分析

进行3次独立的生物重复，每个样本由每个样本3个渗透的叶子和随后的细胞计数组成。

注意：以下所有步骤均使用Kaluza流式细胞分析软件1.2版（Beckman Coulter，US）进行。

在x轴上使用GFP制作点图，在y轴上制作每个样品的mCherry，并使用模拟样品设置背景荧光参数，方法是在模拟细胞群周围拖动象限分隔物（图5A。模拟）。
将模拟设置复制到每个样本并计算每个象限（Q1，Q2，Q3，Q4）中的细胞百分比（图5A）。
计算总GFP群体中的仅GFP细胞数[（Q4 /（Q3 + Q4）]并将其与MP和非MP进行比较。这些最终百分比可以在聚类柱图中直观地表示（图5B）。
注意：从点图（图5A）可以看出，只有mCherry种群（Q2）在Six5存在下也会发生变化。这是由于Avr2-GFP不仅转移到未转化的细胞，而且转移到mCherry-only细胞，将它们转移到mCherry + GFP群体（Q3）。
计算重复的平均值，并使用配对的 t - 测试来确定MP和非MP之间是否存在显着差异（图5C）。

图5.通过荧光辅助细胞计数定量Avr2-GFP易位。：一种。为了评估Six5介导的Avr2-GFP易位，从Avr2-GFP / mCherry-HDEL农杆菌浸润的叶中分离原生质体，并且使用流式细胞术计数仅显示绿色，仅显示红色或者绿色和红色荧光的细胞数。使用未转化的细胞（模拟）作为参考确定背景自发荧光水平。基于模拟，在表达Avr2-GFP / mCherry-HDEL构建体后建立四个象限：Q1，未转化的细胞; Q2，仅表达mCherry的细胞; Q3，表达mCherry + GFP的细胞;和Q4，仅累积GFP。在存在Six5（移动Avr2-GFP）的情况下，与GUS浸润（非移动Avr2-GFP）相比，在Q4中观察到更多数量的仅GFP细胞。在正常（单数）MP的情况下，Avr2-GFP可以用作非MP控制。 B.三个定量重复的示例图。 C.汇总数据，包括量化测量I-III和统计分析。配对t检验显示与 P 值的显着差异。 0.0001（****）。误差棒表示标准误差。上图是根据Cao 等（2018）改编和修改的。

笔记

作为非MP对照，可以使用Avr2-GFP（Cao et al。，2018）（Addgene＃118011）。作为MP控制Avr2-GFP / Six5组合（Cao et al。，2018）或NSm蛋白（Feng et al。，2016）（Addgene＃118011-） 13）可以使用。

食谱

MMAi（新鲜的）
5 g / L MS基础盐混合物（没有gamborg B5维生素的Murashige和Skoog培养基）
20克/升蔗糖
10 mM MES
200μM乙酰丁香酮
TEX缓冲液（1升）
3.1 g / L Gamborg B5培养基
500 mg / L MES
750 mg / L CaCl 2 •2H 2 O
250 mg / L NH 4 NO 3
136.9克/升蔗糖
溶于1升MilliQ水，pH 5.7（含1 M KOH），过滤灭菌（0.45μm孔），储存于4°C
10x叶子消化液
2％w / v macerozyme R-10
4％w / v纤维素酶Onozuka RS
溶于TEX缓冲液（100毫升足以进行100次消化）
混合至少30分钟，然后以3,000 x g 离心15分钟
用0.45μm孔径过滤器过滤灭菌上清液，在50 ml管中制备5 ml等分试样并储存在-20°C
使用前用TEX缓冲液稀释至总体积50 ml

致谢

我们感谢LCAM-FNWI对共聚焦显微镜的支持以及Ben Cornelissen和Nico Tintor对手稿的反馈。所提出的协议的一部分是基于Ma 等人的先前研究，2012和Faraco 等人。，2011。这项工作得到了NWO-Earth和Life的支持。科学资助VICI项目编号865.14.003。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

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Faraco，M.，Di Sansebastiano，G.P.，Spelled，K.，Koes，R.E。和Quattrocchio，F。M.（2011）。一个原生质体不是另一个！植物生理学 156 （2）：474-478。
Feng，Z.，Xue，F.，Xu，M.，Chen，X.，Zhao，W.，Garcia-Murria，MJ，Mingarro，I.，Liu，Y.，Huang，Y.，Jiang，L。，Zhu，M。和Tao，X。（2016）。 ER膜转运系统对NSm运动蛋白和番茄斑萎病毒的细胞间运输至关重要。 PLoS Pathog 12（2）：e1005443。
Gerlitz，N.，Gerum，R.，Sauer，N。和Stadler，R。（2018）。 Photoinducible DRONPA-s：用于调查细胞间连接的新工具。 Plant J 94（5）：751-766。
Green，M。R.和Sambrook，J。（2012）。分子克隆：实验室手册（第4版）。冷泉港实验室出版社。
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Schindelin，J.，Arganda-Carreras，I.，Frize，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B 。，Tinevez，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri，K.，Tomancak，P。和Cardona，A。（2012）。斐济：生物图像分析的开源平台。 Nat方法 9（7）：676-682。