材料和试剂

材料
1. 1.5 ml microtubes（Ultident Scientific，目录号：87-B150-C）
2. 10厘米细胞培养皿（Falcon，Fisher Scientific，目录号：08-772-E）＆nbsp;
3. 15厘米细胞培养皿（Falcon，Fisher Scientific，目录号：08-772-6）
4. 24孔聚苯乙烯培养板（Corning Life Sciences，Fisher Scientific，目录号：08-772-1）＆nbsp;
5. MCE0.45μm过滤器，直径30 mm（Ultident Scientific，目录号：229753）＆nbsp;
6. 20毫升无菌注射器（Ultident Scientific，目录号：BD-302830）＆nbsp;
7. 15毫升无菌锥形管（Falcon，Fisher Scientific，目录号：352096）＆nbsp;
8. 1号盖玻片（直径：12 mm，厚度：0.13至0.17 mm），通过高压灭菌消毒（Fisher Scientific，目录号：12-545-80）
9. 显微镜载玻片，磨砂透明玻璃，26 mm x 76 mm，厚1-1.2 mm（Ultident Scientific，目录号：170-8105-W）
10. 吸水纸
11. 封口膜
12. 铝箔
病毒
1. ZIKV MR766（非洲谱系）（EVAg，目录号：001v-EVA143）（根据原料和转让协议。通过历史：P5。在-80°C下储存原始干燥的原料）
2. ZIKV H / PF / 2013（亚洲谱系）（EVAg，目录号：001v-EVA1545）（根据材料和转让协议。通过历史：P6。将原始干燥的原料储存在-80°C）
细胞系
1. Vero E6猴子上皮细胞（来自阿尔伯塔大学Tom Hobman和Anil Kumar博士的礼物）（ATCC，目录号：CRL-1586）
2. Huh7肝癌细胞（来自PatrickLabonté博士，INRS的礼物）（Creative Bioarray，目录号：CSC-C9441L）
  或者，该细胞系通常可从大多数从事丙型肝炎病毒或DENV的实验室获得。
试剂
1. UltraPure蒸馏水（Life Technologies，目录号：10977-015）＆nbsp;
2. Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，目录号：111965-092）＆nbsp;
3. 胎牛血清（FBS）表现（Wisent，目录号：098150）＆nbsp;
4. 青霉素 - 链霉素（Life Technologies，目录号：15140-122）＆nbsp;
5. MEM非必需氨基酸溶液（100x）（Life Technologies，目录号：11140-050）
6. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，目录号：14190-144）
7. 1 M HEPES缓冲液，pH范围：7.2-7.5（Life Technologies，目录号：15630-080）
8. 0.25％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，目录号：25200-072）＆nbsp;
9. 含L-谷氨酰胺的最低必需培养基（MEM）（Life Technologies，目录号：11095-080）＆nbsp;
10. 羧甲基纤维素（CMC）钠盐，中等粘度（Sigma-Aldrich，目录号：21902-100G）
11. 37％甲醛（Fisher Scientific，目录号：BP531-500）＆nbsp;
12. 结晶紫（Fisher Scientific，目录号：C581-100）＆nbsp;
13. 95％乙醇（商品醇，目录号：1011C）
14. Triton X-100（Mallinktrot，目录号：3555）
15. 4％多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148-1KG）
16. 普通山羊血清（Thermo-Fisher，目录号：01-6201）
17. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A-9647）
18. 叠氮化钠（Fisher Scientific，目录号：BP922I-500）
19. 兔多克隆抗ZIKV NS4B（GeneTex，目录号：GTX133311;稀释度1：200）
20. 小鼠单克隆抗dsRNA，克隆J2（Scicons，目录号：10010200;稀释度1：400）
21. 兔多克隆抗DENV NS4B（GeneTex，目录号：GTX124250;稀释度1：1,000）
22. 小鼠单克隆抗DENV NS3，克隆GT2811（GeneTex，目录号：GTX629477;稀释度1：100）
23. 小鼠单克隆panflaviviral anti-E，克隆4G2（Sigma-Aldrich，目录号：MAB10216，稀释度1：200）
24. 山羊抗兔AlexaFluor 488（Life Technologies，目录号：A11034）
25. 山羊抗小鼠AlexaFluor 568（Life Technologies，目录号：A11004）
26. 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Life Technologies，目录号：D1306）
27. Fluoromount G（Southern Biotech，目录号：0100-01）
28. 完整的DMEM（见食谱）
29. Plaquing medium（MEM-CMC）（见食谱）
30. 甲醛固定剂（见食谱）
31. 多聚甲醛固定剂（见食谱）
32. 结晶紫染色液（见食谱）
33. Triton X-100透化液（见食谱）
34. BSA阻断解决方案（见食谱）

设备

-80°C冰箱
涡流混合器
吸管
烧杯
CO 2 培养箱
血球
电磁搅拌机
BSL2细胞培养柜
2D摇摆平台振动筛
蔡司LSM780共聚焦显微镜
化学罩
镊子
4°C冰箱
可高压灭菌的玻璃瓶
高压灭菌器

程序

重要注意事项：所有活病毒实验（即所有预固定步骤）均应在生物安全2级（BSL2）或BSL2 +组织培养实验室内根据国家和机构法规以及寨卡病毒所需许可进行。处理和储存。

病毒库存生产
1. 病毒准备
  1. 通过在室温下在BSL2细胞培养箱中上下移液，用200μlUltraPure无菌水重悬干燥的病毒原种。＆nbsp;
  2. 在无菌微管中等分50μl病毒并储存在-80℃。
2. 病毒扩增
  第-1天：感染细胞的准备
  1. 从15cm培养的Vero E6细胞培养皿中制备细胞，显示80％-100％汇合。 PBS，完全DMEM和胰蛋白酶-EDTA应在37°C预热。值得一提的是，我们从未使用Vero E6细胞“老”超过50代，因为这可能会影响ZIKV细胞的放射性和病毒产量。＆nbsp;
  2. 取出培养基。
  3. 用10ml PBS洗涤细胞。
  4. 取出PBS，加入7 ml胰蛋白酶-EDTA。
  5. 在37℃下在CO 2 培养箱中孵育2分钟。
  6. 删除胰蛋白酶-EDTA。＆nbsp;
  7. 彻底轻拍细胞培养皿，以便分离细胞。＆nbsp;
  8. 将细胞重悬于10 ml完全DMEM中（参见食谱部分的组成）。＆nbsp;
  9. 将细胞转移到15ml无菌管中。
  10. 使用血细胞计数器，确定每毫升细胞数。＆nbsp;
  11. 在10cm细胞培养皿中的8ml完全DMEM中培养2×10 6个 Vero E6细胞，并在37℃培养箱中孵育过夜。＆nbsp;
  第0天：感染
  1. 在15ml无菌试管中，在6ml完全DMEM中稀释50μl病毒原液。
  2. 通过吸入Vero E6细胞培养基除去。细胞应显示约70％-80％的汇合。＆nbsp;
  注意：在细胞上轻轻加入病毒稀释液，慢慢摇动细胞培养皿。特别是对于第一个试验实验，我们建议包括一个未感染细胞（模拟感染）的对照培养皿，它将平行培养（参见下面的重要说明）。
  1. 在37°C孵育2小时。＆nbsp;
  2. 孵育后，去除病毒接种物。＆nbsp;
  3. 加入8毫升预热的完全DMEM。＆nbsp;
  4. 在37°C孵育3天。
  ＆nbsp;＆nbsp;
  感染后第3,4,5,6和7天：病毒收获
  1. 在每天，直接从细胞培养皿中用无菌20ml注射器收集上清液。在注射器尖端放置MCE0.45μm过滤器。
  2. 将上清液过滤到15毫升无菌管中。＆nbsp;
  3. 在细胞培养皿中加入8 ml完全DMEM，然后将其放回培养箱中。＆nbsp;
  4. 在过滤的上清液中加入80μlHEPES缓冲液1M，pH 7.2-7.5（终浓度10mM）。这将防止冻/融后病毒原种的酸化，并有助于维持最佳的病毒感染性。＆nbsp;
  5. 将病毒上清液分装到无菌的1.5ml微管中（每管1ml）。＆nbsp;
  6. 将等分试样储存在-80°C。
  7. 使用噬斑测定法对每个收获物进行病毒滴定。＆nbsp;
  重要注意事项：在病毒扩增期间，可观察到ZIKV诱导的导致细胞死亡的细胞病变效应，并随着时间的推移而增加。这通常是病毒感染和生产成功的良好迹象。作为健康细胞的参考，可以平行观察模拟感染控制培养皿。＆nbsp;
使用噬斑测定进行病毒滴定
第-1天：感染细胞的准备
注意：
1. 细胞应从15厘米Vero E6培养皿中制备，80％-100％汇合。＆nbsp;
2. 一个汇合的15-cm细胞培养皿通常足以制备5个24孔板，对应于10个样品滴度。 PBS，胰蛋白酶-EDTA和培养基应在37°C预热
1. 通过从培养皿中吸出培养基除去。
2. 用10ml PBS洗涤细胞。
3. 取出PBS，加入7 ml胰蛋白酶-EDTA。
4. 在培养箱中孵育2分钟。＆nbsp;
5. 通过抽吸去除胰蛋白酶。＆nbsp;
6. 彻底轻拍细胞培养皿以分离细胞。
7. 将细胞重悬于10 ml完全DMEM中。＆nbsp;
8. 将细胞转移到无菌的15ml管中。
9. 用血细胞计数器测定细胞浓度。
10. 用完全DMEM稀释细胞至终浓度为4×10 5个/ ml Vero E6细胞/ ml。
11. 种子24孔板，每孔稀释500μl细胞。一个24孔板允许滴定两个病毒样本。＆nbsp;
12. 在37°C孵育过夜。＆nbsp;
第0天：感染
注意：感染当天，细胞应显示90％-100％的汇合。
1. 每个样品准备6个微管以滴定并鉴定它们（10 -1 至10 -6 ）。在每个微管中加入450μl完整的DMEM。＆nbsp;
2. 将系列样品稀释10倍：＆nbsp;
  1. 在第一个微管中加入50μl病毒样品（稀释10 -1 ）。将管涡旋5秒钟。＆nbsp;
  2. 更换尖端以避免样品之间的任何交叉污染。吸取50μl10 -1 稀释液并转移到第二管中（稀释10 -2 ）。将管涡旋5秒钟。＆nbsp;
  3. 对其他稀释液重复这些步骤（10 -3 至10 -6 ）。
3. 从一个24孔板的A行和B行中取出培养基（图1）。
4. 根据图1中所示的板布局，在10 -6 稀释液中上下移液两次，并在A行和B行的最后一侧的孔侧添加200μl相同的尖端。，感染是重复进行的。＆nbsp;
5. 根据平板布局（图1），与其他样品稀释液（10 -5 至10 -1 稀释液）类似地进行。
  重要注意事项：在每次稀释之间更改使用过的吸头至关重要，以避免孔之间的交叉污染。此外，始终从最稀释的样品开始将样品分配到板中。为了避免细胞干燥，在吸取培养基进行另一个稀释系列（例如，行C和D）之前，请务必等待处理一个样品。
  
  图1.用于噬斑测定的系列稀释计划和平板布局用于噬斑测定的病毒原液10倍稀释液和24孔板的示意图。每个板可以滴定两个样品。每种稀释液都以生物学重复进行评估。
6. 一旦24孔板完全处理完毕，将其放回培养箱中，继续进行下一个培养板和两个新样品滴定。
7. 使用2D摇摆平台振荡器在37℃温和搅拌至少1小时孵育所有平板。孵化期可延长至数小时而不影响滴度。
8. 在该温育后，取第一块板并从10 -6 稀释液开始吸出A和B行的上清液以避免交叉污染。
9. 加入孔的一侧，从最高稀释度开始，用10ml移液管加入1ml MEM-CMC（见食谱）。丢弃移液器。重要的是更换每个样品系列之间的移液管，以避免MEM-CMC储备瓶被病毒污染。特别是，快速生长的病毒污染可能会导致未来在孔中出现非常大的斑块的实验，这将无法计算较小的预期斑块。＆nbsp;
10. 重复行C和D，然后对所有板重复。＆nbsp;
11. 在37°C孵育5天。
  重要注意事项：在5天孵化期间不要移动平板，因为这会导致形成“彗星形”斑块，这可能使它们难以计数。
感染后第5天：固定和染色
1. 每孔加入1ml 10％甲醛。
2. 在BSL2实验室中在室温下孵育至少2小时。孵化期可延长至数天。＆nbsp;
3. 通过倒置在化学罩中的大烧杯中丢弃液体。含甲醛的液体废物应根据研究机构的化学品安全规定进行处理。＆nbsp;
4. 通过用自来水剧烈冲洗来清洗板以除去所有甲基纤维素。通过在吸水纸上粘贴板来除去多余的水。＆nbsp;
5. 在细胞单层上加入500μl含结晶紫的染色溶液（见食谱）。
6. 在室温下孵育15分钟。孵化期可延长至数小时。＆nbsp;
7. 在可重复使用的塑料容器中通过倒置除去结晶紫溶液。收集的结晶紫溶液可以转移回原料瓶中，然后重复使用以备将来染色。＆nbsp;
8. 用自来水彻底清洗平板，去除多余的染色液。＆nbsp;
9. 用吸水纸擦干印版，去除多余的水分。＆nbsp;
10. 计算适当稀释度的斑块数量并确定感染性滴度（参见图2和数据分析）。
典型的成像感染实验
第-1天：感染细胞的准备
1. 使用已用70％乙醇清洁的镊子，在24孔培养皿的每个孔中转移无菌盖玻片。
2. 种子Huh7细胞（或任何待测试的细胞系）：500μl完全DMEM中的20,000个细胞。剧烈摇动平板以使细胞均匀地分散在整个孔中。值得注意的是，我们从未使用过比50代更“老”的Huh7细胞，因为我们注意到超过这段经历的形态和生长特性的显着变化。
3. 在37℃下用5％CO 2 孵育过夜。
第0天：病毒感染
1. 对于感染，必须根据库存感染滴度选择适当的感染复数（MOI）和病毒稀释度（参见程序B和数据分析）。对于免疫荧光目的，通常使用1的MOI。 MOI为1意味着平均每个靶细胞接种1个感染性病毒颗粒。＆nbsp;
2. 在这种情况下（20,000个细胞），MOI为1，必须在每个孔中以500μlDMEM的最终体积稀释20,000个病毒。为所有井准备主混合物。
3. 取出培养基，轻轻加入每孔500μlZIKV/ DMEM预混液。
4. 在37℃下用5％CO 2 孵育至少2小时并轻轻搅拌。
5. 除去病毒接种物，每孔加入1 ml完全DMEM。
6. 在37℃下用5％CO 2 孵育48或72小时。
第2天或第3天：固定
1. 删除媒体。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次。
3. 在每个孔中加入500μl4％多聚甲醛/ PBS溶液。
4. 在室温下孵育20分钟，轻轻摇动。
5. 用500μlPBS洗一次，加入1 ml PBS。＆nbsp;
6. 用封口膜密封平板以避免细胞因PBS蒸发而干燥。将固定电池存放在4°C，用铝箔避光。如果没有立即染色，细胞可以在4°C下储存几个月。
共聚焦显微镜的免疫荧光染色
1. 删除PBS。
2. 加入500μlPBS/ Triton X-100透化溶液（参见配方），在室温下温和振荡孵育15分钟。
3. 用PBS洗涤细胞一次。
4. 在透化过程中，新鲜制备阻塞溶液的预混物（参见食谱）。每个要标记的盖玻片计划300μl封闭溶液。
5. 每孔加入300μl完全封闭液。
6. 在室温下孵育1小时，轻轻摇动。
7. 用500μlPBS快速洗涤细胞三次。
8. 准备一抗抗体
  1. 用PBS / 5％BSA / 0.05％叠氮化钠（即，无正常山羊血清的封闭液）稀释兔抗ZIKV NS4B和小鼠抗dsRNA，稀释度为1/200和1/400，分别。每个盖玻片计划30μl抗体溶液。
  2. 或者，抗登革病毒NS4B和NS3的抗体也可用于检测ZIKV，因为这两种黄病毒之间存在抗体表位的交叉反应。使用抗E蛋白的泛黄病毒抗体也是一种考虑因素（参见材料和试剂中的抗体参考和稀释）。
9. 为避免盖玻片干燥并保持足够的湿度，请在底部准备一个带有湿纸的密封容器。
10. 在盒子内的塑料支架上，放置一块用70％乙醇清洗过的封口膜。
11. 对于要标记的每个盖玻片，添加30μl一抗作为滴剂。
12. 用镊子取出一块吸水纸上的多余液体，将每个盖玻片放在抗体滴上，细胞面对封口膜。
13. 在室温下孵育至少2小时，避光。
14. 取回盖玻片并将其转移到无菌24孔板中，每孔含有500μlPBS。细胞必须面向平板顶部。
15. 用500μlPBS洗涤盖玻片三次，每次5分钟。
16. 在最后一次洗涤期间，在PBS / 5％BSA / 0.05％叠氮化钠中以1：1,000的稀释度制备第二荧光标记的抗体。每个盖玻片计划300μl。
17. 用300μl二抗溶液覆盖盖玻片。或者，为了备用试剂，盖玻片可以在抗体滴上温育，与第一抗体孵育完全一样。
18. 在室温下孵育1小时，在2D摇摆振动器上避光。
19. 快速洗涤一次然后，三次至少10分钟，同时用500μlPBS轻轻搅拌。
20. 将DAPI原液稀释10,000倍至PBS中。每个盖玻片计划500μl。＆nbsp;
21. 从培养板中取出PBS，每孔加入500μlDAPI/ PBS。＆nbsp;
22. 孵育10分钟，在室温下轻轻搅拌，避光。
23. 用500μlPBS快速洗涤三次。
24. 用500μl无菌水洗一次。
25. 用70％乙醇清洁显微镜载玻片。每个盖玻片加入5μlFloromountG滴。根据用于成像的显微镜，每个载玻片可容纳3-4个盖玻片。＆nbsp;
26. 通过用一块吸水纸接触其侧面，去除盖玻片上的多余水分。将盖玻片放在载玻片上的Fluoromount G滴，细胞面向滴。
27. 在成像前将载玻片保持在4°C保持过夜。
28. 用共聚焦或落射荧光显微镜对细胞成像，以确定感染的百分比，即，NS4B-或dsRNA-阳性细胞的％。

数据分析

使用噬斑测定法测定病毒原种的感染滴度
1. 计算可以区分的孔中斑块的数量。选择显示最多个体斑块的孔复制品。有关典型示例，请参见图2.＆nbsp;
2. 根据以下公式计算感染性病毒滴度：
3. 将值乘以5，因为病毒接种物为200μl，滴度标准化为1ml相应的ZIKV原液。
病毒滴度的单位是每ml病毒原液的噬斑形成单位（PFU）。一个PFU对应于在第0天最初感染一个靶细胞的一个病毒颗粒。在5天孵育期间，由于含有半固体CMC的培养基，新产生的病毒仅局部扩散。在其晚期时间点，病毒感染最终导致Vero E6细胞中的细胞死亡，导致斑块的形成。斑块不会被结晶紫染色，因为已经洗掉了死细胞。值得注意的是，在Vero E6细胞中，ZIKV H / PF / 2013的斑块大小比MR766大，因为细胞病变效应更高（见图2）。如果斑块是如此之大以至于它们重叠并且无法区分计数，可以提前一天固定细胞以减少斑块大小。另一种方法是使用6孔或12孔板来增加细胞培养面积并更好地分离斑块，从而便于计数。

图2.ZIKV MR766和H / PF / 2013的典型噬斑测定。 Vero E6细胞用10倍连续稀释的ZIKV MR766或H / PF / 2013原种（第3天收获）感染。感染后5天，固定细胞并用结晶紫染色。在这个具体的例子中，斑块可以分别在ZIKV MR766和H / PF / 2013的10 -3 和10 -4 稀释孔中计数（以红色表示）。根据上述公式，MR766的感染滴度为1.3×10 5 sup / 5 PFU / ml，H / PF / 2013为1.45×10 4 PFU / ml。 />
通常，从~10 4 -10 5 PFU / ml开始，取决于实验至~10 7 PFU / ml（图3），两种菌株的感染性滴度在扩增的第一天中以对数方式增加，然后达到平台期。我们从未在感染后1天和2天收集病毒，因为滴度太低而无法进行后续实验。在我们的手中，即使扩增期延长超过7天，也从未达到超过5 x 10 7 PFU / ml的感染性滴度。值得一提的是，如果病毒以及细胞的高通道用于病毒原种生产，则斑块形态和扩增动力学的概况可能会改变。如果相关，应仔细考虑并解决这个问题。

图3.Vero E6细胞中ZIKV毒株MR 766和H / PF / 2013的病毒扩增动力学。 VIK E6细胞用ZIKV MR766或H / PF / 2013株感染，MOI为0.01。在感染后3,4,5,6和7天收集病毒上清液。使用Vero E6细胞中的噬斑测定法测定感染性病毒滴度。
成像
在共聚焦显微镜下观察载玻片，并使用“未感染”条件盖玻片设置检测参数。在这种情况下观察到的任何信号都是非特异性的。对于NS4B抗体，它可能是弥漫性的，而它通常表现为抗dsRNA，因为整个细胞中信号非常弱的小点。尽管抗dsRNA不应该识别小于40个碱基对的RNA螺旋（可能在细胞中不存在或罕见），但它很可能检测到具有低亲和力的细胞高度结构化RNA，解释了未感染细胞中观察到的背景。如果非特异性信号太高，则可以增加透化缓冲液和/或一抗稀释液中的洗涤剂浓度。 dsRNA的ZIKV特异性信号（对应于ZIKV RNA复制中间体）通常显示小的强烈斑点的核周积累，其可能对应于ER衍生的囊泡包内的复制复合物（Chatel-Chaix 等。，2016; Cortese et al。，2017）（图4）。最近显示，dsRNA定位于微管组织中心（MTOC）附近，周围是由重排细胞骨架构成的“笼状”结构（Cortese et al。，2017）.NS4B标记对于两种ZIKV菌株均显示弥散分布，其与dsRNA信号共定位（图4），与DENV NS4B显示为囊泡包的组分的事实一致，如免疫金标记随后电子显微镜所示（Welsch et此外，ZIKV H / PF / 2013 NS4B也在dsRNA簇的外围积聚，在大而强烈的点状结构（直径约1-5μm）中，与DENV NS4B类似，大多数可能对应于复杂的膜，另一个复制工厂子结构（Chatel-Chaix et al。，2016）。
＆NBSP;为了估计感染率，在盖玻片的五个不同区域中计算至少一百个细胞，并计算感染的数量，即，NS4B-和dsRNA阳性。

使用ZIKV MR766在Huh7细胞中以MOI为1在48小时内可重复地实现100％感染率。在感染后72小时，细胞显示出明显的细胞病变效应迹象。相反，在相同的感染条件下，ZIKV H / PF / 2013通常仅在10％的细胞中检测到（在10-20个细胞的感染簇中），在感染后48小时没有细胞死亡的迹象。通过一天后固定细胞可以改善这种感染率。此外，当我们将MOI增加到50时，我们经常在Huh7细胞中达到~100％感染该菌株。在这些条件下，在Huh7细胞中没有观察到明显的细胞病变效应的迹象。

图4.在Huh7细胞中的寨卡病毒感染的成像。用MOI为1的ZIKV MR766或H / PF / 2013株感染Huh7细胞或未感染。感染后48小时，将细胞固定，透化并用抗dsRNA和抗ZIKV NS4B抗体标记。用DAPI染色观察细胞核。用Zeiss LSM780共聚焦显微镜观察细胞。对于ZIKV H / PF / 2013，将显示受感染的群集。比例尺：20μm。
相关评论
重要的是要注意，感染程序可以适用于其他终点读数，例如Western印迹，qPCR或RNA干扰与任何功能测定相结合。出于这些目的，细胞和体积的数量可以根据培养皿或培养板格式上调或下调。用于显微镜实验的细胞密度保持相当低，使得细胞很好地个性化用于成像。因此，值得一提的是，与显微镜实验相比，可以使用更多的细胞，以便可获得足够的生物材料。通常，可以使用那些比率/格式：
1. 10厘米培养皿：1,000,000 Huh7细胞。感染5毫升
2. 6孔板：200,000 Huh7细胞。感染在1毫升
3. 12孔板：100,000 Huh7细胞。感染500μl
4. 24孔板：50,000 Huh7细胞。感染250-300μl
5. 96孔板：10,000 Huh7细胞。感染50μl
＆NBSP;当进行功能测定，例如评估药物或宿主基因表达调节对ZIKV滴度的影响时，应选择低MOI（对于Huh7细胞通常在0.01和0.1之间）。实际上，如果使用高MOI，滴度饱和超过10 6 PFU / ml的事实可能掩盖了一些表型。使用低MOI可确保在收集样本时病毒复制处于其对数动态窗口中。
＆NBSP;最后，理论上任何细胞系或原代细胞都可以允许ZIKV感染。为了测试这一点，我们通常进行复制动力学实验，其中我们用MOI为1的ZIKV感染细胞。收集细胞上清液并在感染后1,2,3和4天过滤，类似于ZIKV原种收获。然后使用噬斑测定评估推定的上清液相关感染性。可以使用本手册中描述的方案确定感染百分比。值得注意的是，应始终牢记使用噬斑测定法测定的感染性滴度与VIK E6细胞对ZIKV的放射性相关。由于给定的测试细胞系（例如，病毒受体可用性/表达，抗病毒应答的高诱导...）和/或病毒株所固有的许多可能原因，感染率可能低，即使用MOI为1.为了规避这一限制，MOI可能会增加到10-50，并且感染程序在未来的实验中得到优化（例如，感染时间，接种物中血清的存在......）最终达到接近100％的价值。

食谱

完成DMEM
500毫升DMEM
50毫升FBS性能
5毫升青霉素/链霉素
5毫升非必需氨基酸溶液
储存在4°C
Plaquing medium（MEM-CMC）
1. 将7.5 g CMC放入装有磁棒的可高压灭菌的玻璃瓶中
2. 高压灭菌瓶子对粉末和搅拌器进行灭菌（121°C，30分钟，20巴;干燥25分钟）
  C。在细胞培养箱的无菌环境中加入500ml MEM瓶中。用手接触瓶子而不接触瓶颈。通过倒置混合。将原始MEM瓶保持在4°C以备进一步使用（见下文）
  d。将MEM / CMC瓶在4℃下在磁力搅拌板上孵育直至CMC完全溶解。这通常需要两到三天。
  即将重构的培养基从玻璃瓶转移到细胞培养箱的无菌环境内的原始MEM塑料瓶中。这将避免将任何玻璃制材料引入BSL2区域 F。储存在4°C。 CMC的最终浓度为1.5％
甲醛固定剂
270毫升蒸馏水
100毫升37％甲醛（终浓度10％）
在室温下储存
多聚甲醛固定剂
1 L 1x PBS
40克多聚甲醛（4％终浓度）
通过在化学罩内加热（~60-70°C）制剂约30分钟来促进溶解多聚甲醛
在15 ml管中制备12 ml等分试样并储存在-20°C
结晶紫染色液
5克水晶紫
溶于52.6毫升95％乙醇中加入445毫升双蒸水
结晶紫和乙醇的最终浓度分别为1％和10％在室温下储存
Triton X-100透化液
500毫升PBS
1毫升Triton X-100（终浓度0.2％）
在室温下储存
BSA封锁解决方案
1. 将10 g BSA溶于200 ml PBS（5％[w / v]终浓度）
2. 加入1 ml 10％（w / v）叠氮化钠溶液（NaN 3 ;终浓度：0.05％）
3. 储存在4°C
注意：
1. 可选：溶液可以通过过滤灭菌，以避免污染，并在几个月内保持溶液的质量。
2. 免疫荧光染色当天，用正常山羊血清补充溶液至终浓度为10％（v / v）。

致谢

LCC正在接受魁北克省圣保罗基金会（FRQS）的研究学者（初级2）工资支持。 LCC的研究得到了加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC; RGPIN-2016-05584），加拿大卫生研究院（CIHR; PJT153020; ICS154142），魁北克省自然科学基金会（CEDT de la Recherche duQuébec-Nature et Technologies）的资助（ FRQNT; 2018-NC-205593），Armand-Frappier Foundation和Institut National de la Recherche Scientifique。该协议主要改编自我们之前的工作（Chatel-Chaix et al。，2016）中使用的实验程序，其中我们优化了ZIKV的生产和检测。我们感谢欧洲病毒档案全球（EVAg）和Xavier de Lamballerie博士（Aix-Marseille大学的病理学Virales），提供ZIKV MR766和H / PF / 2013原始库存。我们感谢PatrickLabonté（国立科学研究院），Tom Hobman（阿尔伯塔大学）和Anil Kumar（阿尔伯塔大学）慷慨地提供Huh7和Vero E6细胞。

利益争夺

作者声明他们没有任何利益冲突或竞争利益。

参考

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