材料和试剂

移液器吸头
微量离心管（1.5 ml）（Eppendorf，目录号：0030120086）
离心管（Sigma-Aldrich，型号：Greiner 15 ml，目录号：T1818）
显微镜载玻片（Continental Lab Products，目录号：7105）
显微镜盖玻璃22 x 22 mm（Paul Marienfeld GmbH＆amp; Co，Marienfeld SUPERIOR，目录号：0101050）
GF / C级玻璃微纤维过滤器，25 mm圆形，1.2μm孔径（Whatman，目录号：1822-025）
C末端GFP标记的Rhp54 S. pombe 菌株（Tang et al。，2015; Lim et al。，2018）
972， S. pombe 野生型（WT）菌株（没有任何GFP标记）（Lim et al。，2018）
甲基磺酸甲酯（MMS）99％库存（西格玛奥德里奇，目录号：129925）
注意：MMS是一种有毒物质，是一种潜在的致癌物质。使用时，使用者应穿戴所有防护服。含有MMS的废弃介质应放置在容器中，用于细胞毒性废物，然后由许可的化学废物处理公司处理。
甲醇（AR级）100％（Fisher Scientific，目录号：10284580）
用于细胞核染色的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D8417）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S5136）
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
盐酸37％（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
酵母提取物（BD Biosciences，Bacto TM ，目录号：212750）
腺嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：A8626）
葡萄糖（西格玛奥德里奇，目录号：G8270）
用于显微镜的浸油（尼康，产品目录号：MXA20235）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
2 N盐酸（HCl）（见食谱）
用于细胞生长的酵母提取物腺嘌呤（YEA）培养基（参见食谱）

设备

P20 Pipetman（吉尔森，产品目录号：F123600）
P200 Pipetman（吉尔森，产品目录号：F123601）
P1000 Pipetman（吉尔森，产品目录号：F123602）
锥形瓶，250毫升（Kartell，目录号：1462）
振荡器培养箱（Eppendorf，型号：Innova ® 44，目录号：M1282-0002）
倒置荧光显微镜（例如，尼康;型号：Eclipse Ti-E）配：
1. 油浸物镜（尼康;型号：CFI PLAN APO VC 100XH 1.4 NA）＆nbsp;
2. DAPI滤波器（激发λ：350nm;发射λ：460nm）（色度;型号：ET-DAPI;目录号：49000）
3. FITC滤光片（激发λ：480nm;发射λ：535nm）（色度;型号：FITC / EGFP / Bodipy FI / Fluo3 / DiO;目录号：41001）＆nbsp;
4. 数码相机（Hamamatsu;型号：ORCA-Flash2.8;目录号：C11440-10C）
低温冰箱（-80°C）（赛默飞世尔科技，型号：Forma TM 700系列）＆nbsp;
冷藏离心机（4°C）（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MX-305）
镊子（Sigma-Aldrich，目录号：F4267）
分光光度计（Biochrom，ULTRASPEC，目录号：80-2116-30）
真空过滤器套件，由锥形收集瓶和过滤器支架组成（Fisherbrand，目录号：09-753G）
真空泵（Rocker Scientific，型号：Rocker 400，目录号：167400-11（22））
高压灭菌器（ALP，型号：CL-40M）

软件

具有扩展焦深（EDF）和通用分析插件的尼康NIS Elements AR（v5.02）（从尼康公司购买）
Microsoft Office 365-Excel

程序

样品制备
1. 对于每个样品，在15ml离心管中制备3ml 100％甲醇，并在固定前在-80℃预冷至少1小时。
2. 对于每个菌株，每个时间点接种至少10ml细胞并在YEA中在30℃下在振荡培养箱中生长过夜（~16小时）至0.25的光密度（OD 600nm ）。 110转。 OD由分光光度计确定。
  注意：例如，如果有5个时间点（例如0,1,2,3和4小时），则在锥形瓶中培养50 ml（5 x 10 ml）细胞培养物。 / EM>
3. 将0.01％的99％MMS原料添加到细胞培养物中并开始计时。
  注意：MMS可以用其他药物或治疗方法替代，这些药物或治疗方法会引发病灶形成。
4. 作为GFP信号的阴性对照，使用步骤A2中的条件，将没有任何GFP标记（WT）的10ml野生型菌株生长至OD 600nm 0.5。＆nbsp;
细胞采集和固定
1. 将培养物通过装有玻璃微纤维过滤器的真空过滤器支架，收集10毫升细胞。
  注意：让真空泵再打开几秒钟以确保大部分液体被清除。
2. 使用镊子立即将含有细胞的过滤器浸入预冷的甲醇中。对其他时间点重复此过程
3. 将细胞在-80℃保持至少15分钟或最多2至3周，将细胞固定在甲醇中。
细胞补液
注意：在整个补液过程中将管子保持在冰上。
1. 将1ml冰冷的1x PBS加入15ml管中，倒置混合。通过反复移液过滤器表面上的15 ml管内的PBS-甲醇混合物，从滤纸中取出细胞，然后用镊子从溶液中取出滤盘。
  注意：轻轻地移动细胞会防止产生过多的纤维，这会在安装在载玻片上时造成不均匀。
2. 通过逐渐加入6ml冰冷的1x PBS补充细胞，即，加入1 ml，倒入混合物，再加1 ml并混合。
  注意：不要同时添加所有6毫升，因为这可能会破坏细胞。
3. 在1,600 x g 离心1分钟以收集细胞沉淀。
4. 除去上清液，将细胞转移到含有1ml 1x PBS的1.5ml微量离心管中。
5. 每次用1ml冰冷的1x PBS洗涤三次。＆nbsp;
6. 将细胞重悬于20μl冰冷的1x PBS中，并保持冰上直至观察。
  注意：观察必须在样品再水化的同一天进行。
图像采集
1. 要观察Rhp54-GFP信号，将1μl含有等体积1μg/ ml DAPI的细胞装在载玻片上，盖上显微镜盖玻片。
  注意：在当前的实验程序中使用厚度为1的盖片。为获得最佳效果，请使用厚度建议用于每种显微镜镜片的盖玻片。不需要密封载玻片，因为样品在安装后立即可视化。
2. 观察 S.使用荧光显微镜观察具有100倍放大率物镜的pombe 细胞。
  注意：我们使用带有NIS-Elements Advance Research软件（v5.02）的Nikon Eclipse Ti-E显微镜系统作为示例。＆nbsp;
3. 设置自动图像采集参数（ND采集）：首先捕获DAPI的静止图像，然后为GFP采用Z-stack。
  注意：获取Z-堆叠图像很重要，因为焦点可能只聚焦在某些焦平面上。捕获的图像数量定义了分辨率。为了精确定量和重建核图像，根据奈奎斯特 - 香农采样定理，每个步骤需要285纳米的Z切片（基于100倍放大率和1.4纳米的客观油透镜）（Shannon，1949）。这相当于总深度为4μm的~14个Z步。＆nbsp;
4. 为了避免在运行Z扫描时光漂白，首先通过观察DAPI染色的细胞核来聚焦细胞。准备好后，单击“立即运行”按钮以进行自动图像采集。捕获的图像将自动保存到预定目标文件夹中。
  注意：在Z轴扫描期间，当焦平面移离前一个光漂白区域时，应观察到新的视野。＆nbsp;
5. 用足够数量的单元捕获足够数量的图像＆gt;每个样本500个。
  注意：同一实验中的所有菌株都需要在同一天连续拍摄图像（不打开/关闭显微镜或调整光源），以确保一致性和应变间的可比性。
6. DAPI和Z-stack GFP的组合图像将保存为 .nd2 文件格式。
图像处理
1. 要将来自不同Z轴的GFP图像组合成单个聚焦框架，请打开 .nd2 图像，单击“创建EDF聚焦文档”按钮（图1A）。
  注意：EDF模块的功能是将每个平面中的聚焦部分组合成一个聚焦图像。
2. 为了标准化EDF后图像背景强度的变化，选择“绘制方形背景ROI”并选择一个没有任何单元格的区域（图1B）。选择“使用ROI减去背景”以删除背景。
3. 为了增强GFP焦点的强度以便软件更容易检测，请从菜单栏中选择：图像＆gt;局部对比度＆gt;设置为3度，半径为0.65μm。
  注意：局部对比度是一种数字图像处理步骤，用于增加图像相对于局部环境的对比度，旨在强调细节或锐化图像。 “度”是对比度乘数或对比度放大的量值。 “半径”是要处理的相邻区域（像素）的大小。当半径值较小时，它将使亮像素变亮，同时使较暗的相邻像素变暗以增强较小尺寸的细节。增加半径值会使较宽的相邻区域可见，但会导致细节丢失，在这种情况下会导致GFP焦点。因此，必须设置“度”和“半径”，以便可以增强GFP的精细细节，同时不夸张。＆nbsp;
4. 保存 .nd2 文件。
5. 对其他图像重复步骤E1-E4。
  
  图1.创建聚焦图像并消除背景噪声。 A.按钮创建以EDF为中心的图像。 B.红色框表示在图像上定义背景区域所需的选择。
GFP焦点的优化和测定（批处理）
应使用阳性对照菌株的图像作为参考，以确定GFP焦点定量的参数。在Lim 等人（2018）的情况下，使用MMS处理4小时的野生型Rhp54-GFP细胞来建立参数。 DAPI和GFP信号的图像示例如图2所示。

图2. DAPI和GFP图像的示例。单个 .nd2 文件由DAPI和GFP通道的图像组成。两个通道的合并图像显示Rhp54-GFP信号定位于细胞核。比例尺：10μm。＆nbsp;
1. 打开已处理的 .nd2 图像（在步骤E4之后完成EDF和背景减法）;在菜单栏中，选择图像＆gt;一般分析。
2. 在General Analysis窗口的“Analysis Palette”下（图3A），选择“Add Channel”以添加DAPI和FITC（GFP）通道（图3B）。
3. 要定义DAPI检测参数，请选择左侧的DAPI和右侧的阈值，并相应调整（图3A和3B）。所做的更改将在图像上实时显示，如图3C所示;蓝色信号表示调整阈值后定义的DAPI区域。
  注意：确保在窗口底部勾选“预览”框以实时查看更改。见注1。
4. 对于FITC（GFP），选择“亮点检测”（图3D，右侧红色框;图3E）并相应调整其他参数，直到图像上出现的粉红色斑点数与眼睛观察到的GFP焦点数相匹配（图3F）。见注2
  
  图3.调整用于检测DAPI和GFP信号的参数。 A.选择DAPI通道（红色框，左侧）并调整阈值和其他参数（红色框，右侧）。所做的更改将实时反映在图像上，如图C所示.B。在A中用红色框出的区域的放大视图.C.在调整阈值之前和之后的DAPI图像。蓝色信号表示DAPI区域。比例尺：10μm。 D.选择FITC通道（红色框，左侧）并调整亮点检测的参数（红色框，右侧）。所做的更改将实时反映在图像上，如FE所示。参数调整前后的DF图像中的红色区域的放大视图，以及DAPI和GFP焦点的合并视图检测。粉红色信号表示GFP焦点。比例尺：10μm。
5. 要计算细胞核中的GFP焦点数，在“分析调色板”下选择“添加组合层”（图3B）并调整以下标准：ROI =“DAPI”，Feature =“Count”，Measured On =“FITC”（图4A和4B）。以 .ga 格式保存最终参数。
6. 按“立即运行”，计数结果将显示在“自动测量结果”表中（图4C），“Source”表示图像文件名，“RoiID”表示每个识别出的DAPI阳性病灶，以及“NumberObjects”表示所鉴定的GFP阳性病灶的数量。
  
  图4. DAPI信号内GFP焦点的定量。：一种。通过选择“Analysis Palette＆gt;添加”DAPI内的测量“。添加组合层“并具有以下标准：ROI =”DAPI“，Feature =”Count“，Measured On =”FITC“。 B.放大AC自动测量结果表中红色区域的放大视图，“Source”表示图像文件名，“RoiID”表示每个识别的DAPI，“NumberObjects”表示GFP焦点的数量。特定的DAPI信号。
7. 要批量处理所有图像，请在菜单栏中选择：图像＆gt; Analysis Explorer。选择将用于批次分析的方法或标准（图5A）。在这种情况下，选择“一般分析”;如图4A所示，“分析名称”是“一般分析”。或者，也可以加载先前设置的参数（ .ga 文件）。然后单击“批处理”。
8. 在“批量分析”窗口中，选择文件夹的位置和要处理的图像文件，然后按“运行”（图5B）。处理完图像后，结果将显示在“自动测量结果”窗口中，如图4C所示。将原始数据导出到Microsoft Excel进行数据分析。
  注意：设置的阈值或参数只能用于同一天拍摄的样本。
  
  图5.批量处理图像。：一种。 Analysis Explorer显示以前处理的文件和使用的参数。 B.“批量分析”用于选择要使用相同参数为批处理选择的 .nd2 文件。
分析从其他显微镜系统获得的图像
从其他显微镜系统获得的DAPI和GFP Z-堆叠图像也可以使用Nikon NIS Elements软件进行分析，还有一些额外的步骤。
1. Z-stack图像必须在原始显微镜系统中导出为单独的 .tif 格式图像。
  注意：如果Z-stack有7个步骤，导出后将获得7个单独的图像。
2. 确保文件名按顺序排列。例如 D1.tif，D2.tif，D3.tif ... D7.tif 。
3. 在菜单栏中，选择：文件＆gt;导入/导出＆gt;从文件序列创建ND文件。
4. 选择包含单个Z-stack图像的文件夹，然后选择“Z Series”（红色框，图6A）并按“Convert”。这会将GFP图像转换为单个 .nd2 文件。
5. 如果图像是RGB，则在步骤G4之后，在菜单栏中选择：图像＆gt;转换＆gt;转换为灰色（图6B）。应在DAPI图像上执行此步骤。
6. 在GFP Z-stack图像上，通过选择“Create EDF Focused Document”按钮创建单个聚焦图像（图1A）。
7. 要重叠DAPI和GFP图像，请将具有EDF后GFP图像的窗口拖动到DAPI图像中，以创建单个重叠 .nd2 文件。
8. 继续执行步骤E2至F8。
  
  图6.从其他显微镜系统获得的图像转换。：一种。各个Z-stack图像将合并为一个Z-stack .nd2 文件。红框：选择“Z系列”以创建Z-stack文件。 B.将随机RGB图像（左）转换为灰度图像（右）。请注意，在窗口底部，它从三种颜色（红色，绿色，蓝色）变为一种（灰色）。显示的图像是在NIS-Elements Advance Research软件中获得的样本图像。

数据分析

在导出的Excel工作表中，根据焦点的数量量化单元格的数量。
计数具有多于4个GFP焦点（> 4）的细胞，并表示为计数的细胞总数的百分比。
对其他时间点和样本应用类似的程序，以便可以相互比较。
具有超过4个GFP焦点（> 4）的细胞相对于时间的百分比图。
注意：软件在单元中识别的不同数量的GFP焦点的示例（图7）。图中仅包含含有超过4个GFP焦点的细胞（图9A）。见注3。

图7.通过软件识别的具有不同数量的GFP焦点的细胞。基于先前在步骤F4中设置的参数，所识别的GFP焦点显示为粉红色点，并且实际计数将记录为如图4C。比例尺：10μm。

笔记

在检测中包括非核DAPI染色的细胞（步骤F3）。
建议：为了确保更高的准确性并减少GFP焦点的非特异性计数，在批次运行后，手动从计数中去除非特异性DAPI染色区域。细胞核由DAPI染色区域的圆形定义，并且通常位于G2期细胞的中间或者在有丝分裂细胞的每一端出现两个，一个。图8A显示了用DAPI和其他非特异性染色（噪音）染色的细胞核的实例。
1. 在二进制工具栏上，选择“删除对象”，单击由软件定义的DAPI信号（噪声）并将其删除（图8B）。
2. 选择“自动检测”并单击要选择细胞核的区域（图8B）。在修改之后，在图4B中，选择“更新测量”。
  
  图8.二元工具栏，用于手动定义细胞核区域并去除非特异性DAPI染色。：一种。 DAPI染色细胞（左）的原始图像和由蓝色（右）中出现的软件识别的细胞核区域。箭头突出显示在分析之前去除的非核染色噪音。比例尺：10μm。 B.使用设置参数由软件识别的信号可以使用二进制工具栏手动编辑。 “删除对象”用于取消选择噪声和任何其他错误定义的区域。 “自动检测”是重新定义细胞核区域（DAPI信号）。
由软件确定的焦点数量低于目视观察值（步骤F4）。
建议：由于样本批次之间的GFP强度不同，即使使用类似的菌株，类似的参数也不能应用于在不同日期拍摄的图像。因此，对于每批样品，初始确定参数需要野生型。如果初始GFP强度太低，则需要通过调整局部对比度（步骤E3）进一步增强GFP信号，直到软件能够识别用肉眼看到的斑点数量。＆nbsp;
当组合实验的三次重复时，标准偏差（SD）很大，从而掩盖野生型和突变菌株之间的差异（如果有的话）。
建议：不建议将所有生物重复组合用于计算平均值和SD。相反，最好在单独的集合中显示数据以显示趋势的可重复性。或者，结果可以显示为相对值，使得来自不同菌株和时间点的所有值在最终时间点归一化为野生型的值（例如，野生型4小时后添加MMS）。例如，以百分比表示的各个时间点的值（图9A和9B）在4小时（46.09％）除以野生型的值，得到相对值（图9B和9C）。通过这种方法，可以最小化不同实验重复之间的差异，以便在来自不同重复的数据结合时进行统计比较。

图9.数据处理示例 A.对具有四个以上GFP焦点的细胞进行定量，并相对于MMS处理的时间作图。黑条：野生型;白条：突变体。 B.从（A）获得的读数相对于野生型在4小时重新计算（用虚线框表示）。 C.在B.
中表示数据
进一步的应用：本文描述的方案可以进一步适用于量化整个细胞中的荧光聚焦信号（包括细胞溶质），而不是简单地在细胞核中进行以下修改。
在步骤F3（图3A）中相应地调整参数，使得蓝色信号包含整个细胞而不是简单的细胞核。在这样做时，软件将在随后的步骤F4-F8中量化整个细胞中存在的焦点数量而不是核心中的焦点数量。

食谱

1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH 2 PO 4
使用2N HCl将pH调节至7.4 高压灭菌并在室温下储存
2 N盐酸（HCl）
41.788毫升蒸馏水
8.212毫升盐酸37％＆nbsp;
用于细胞生长的酵母提取物腺嘌呤（YEA）培养基
在通风橱中，将HCl缓慢加入水中（注意：反之亦然）
5克酵母提取物
75毫克腺嘌呤
30克葡萄糖
1升蒸馏水
使用2N HCl将pH调节至5.5
高压灭菌并在室温下储存

致谢

我们感谢Rebecca Jackson批判性地编辑了这份手稿，并感谢尼康成像中心使用分析软件。这项工作得到了新加坡教育部MOE2016-T2-2-063的支持，授予E.S.C.

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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