材料和试剂

1.带有 Luer 适配器的安全采血装置（Greiner Bio-One，Vacuette ® ，目录号：450081）
2. 4 ml NH肝素钠采血管（Greiner Bio-One，Vacuette ® ，目录号：454051）
3. 50 ml 聚丙烯离心管（Labcon，PerformR TM ，目录号：3186-345）
4. 15 ml 聚丙烯离心管（Labcon，PerformR TM ，目录号：3136-345）
5. 1.5 ml 聚丙烯微量离心管（Labcon，SuperSpin ® ，目录号：3016-870）
6.超速离心管（Beckman Coulter，Quick-Seal 聚丙烯管，钟形管，目录号：365470）
7.贴膜
8. 1 ml注射器（Nipro，目录号：JD+01D2238）
9.注射器过滤器（Whatman，Anotop 10 注射器过滤器，孔径 0.02 μm，目录号：Z747637）
10. ddH 2 O（由 Thermo Fisher Scientific Water Purification System 纯化）
11.收集的人全血，根据机构的生物安全和伦理GUI德尔INES
12. Polymorphprep TM （Axis-Shield，目录号：1114683）
13. RPMI 1640（Gibco，目录号：11530586）
14.红细胞裂解缓冲液（Roche，目录号：11 814 389 001）
15.人AB血清（Thermo Fisher Scientific，Coring Human AB血清100ml，目录号：MT35060CI）
16.乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：60004）
17.玻璃载玻片（Tharmac，目录号：JC311-100）
18.过滤卡（Tharmac，目录号：JC305-200）
19. Cytospin漏斗（Tharmac，Single Cellfunnel，目录号：JC304-12）
20. Cytoclip（Tharmac，Cellspin附件，目录号：JC302-1）
21. Wright's 溶液（默克，Wright's 曙红亚甲蓝溶液，目录号：101383）
22.重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）（Biolegend，目录号：717904）
23. NaCl（Vivantis，目录号：PC0914-1kg ）
24. KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：7758-11-4）
25. KCl（Sigma-Aldrich，目录号：7447-40-7）
26. Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：7558-79-4）
27. HCl（VWR International，目录号：7647-01-0）
28.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）

设备

净水系统（Thermo Scientific，Barnstead Pacific RO，目录号：50132389）
移液器：0.5-10 μl、10-100 μl和100-1,000μ升仪（Eppendorf，的Eppendorf研究加，目录号小号：3120000020，3120000046，3120000060）
天平（Fisher Scientific，型号：Sartorius TM MSE125P100DU）
通用320R离心机配备有一个外开式转子（6 -地方）和固定角转子（24 -地方）（海蒂，型号：UNIVERSAL 320R），离心机转子（海蒂，型号：1619转子）; 离心机附件（海蒂诗，型号：附件 1462-A）；离心转子（海蒂诗，型号：Rotor 1420B）
配备 100Ti 型固定角转子（Beckman Coulter，型号：Optima TM XPN-100）的超速离心机，超速离心机转子（Beckman Coulter，型号：100Ti 型固定角转子，目录号：363013）
水浴设备（Memmert、Waterbath WNB 22）
血细胞计数器（Hausser Scientific，Bright-Line Hemacytometer，目录号：3120）
Cytospin 装置（Tharmac，Cellspin I ）
光学显微镜e （尼康，正置显微镜Eclip 50i）
NanoSight NS300（Malvern Panalytical，O 形环顶板，405 nm 激光）
高压釜（Tomy，目录号：LSX-500）
冰箱 (4°C)（三星，带 FlexZone 的21立方英尺容量顶部冷冻冰箱）
冰箱 (-80°C) (Thermo, 标准性能超低温冰箱)

软件

Nanosight NTA 3.1 软件版本 3.1.54 (Malvern Panalytical)

程序

分离ñ从全血体中性
根据机构生物安全和伦理准则，通过静脉切开术将大约 40 ml的全人血收集到10 × 4 ml 管中，并加入肝素抗凝剂。
将 6 ml Polymorphprep TM添加到 6 × 15 - ml 离心管中。
将 6 ml 全血加入这些管中（Polymorphprep : w/ v= 1:1）。是一定要慢慢增加，因此血液坐在Polymorphprep的顶部TM和两层不要混用。
以 500 × g (Hettich 320R)离心35 分钟（室温）以分离各层（图 1）。

图 1.从下到上分离的层。红细胞 (RBC)、多形核层 (PMN)、外周血单核细胞 (PBMC)、血浆。Polymorphprep TM用于分离纯 PMN 层。

去除对使用1000从溶液lasma和外周血单核细胞层-微升移液管。
收集较低的 PMN 层并放入 3 × 15 - ml 离心管中。避开底部的红细胞层。
向每个管中加入 1-2 ml RPMI 1640。
注：添加一些额外的RPMI 1640需要等于IZE卷中的所有管。这将恩确保离心机平衡。
以 500 × g (Hettich 320R)离心5 分钟（室温）以清洗 PMN 层并去除任何残留的 Polymorphprep TM 。
除去上清液，加入9毫升的红细胞裂解缓冲液与1ml沿的RPMI 1640（V / V比9：1）进行重悬沉淀。裂解缓冲液将通过低渗细胞裂解去除任何污染的红细胞 (RBC)。在室温下孵育 3 分钟。
以 400 × g (Hettich 320R)离心3 分钟（室温）。该p产生将包含嗜中性粒细胞ellet。
除去上清，重悬在1毫升的中性粒细胞沉淀的RPMI 1640计数使用血球细胞的数量。
加入适量的RPMI 1640（约 200 - 600 μl），将中性粒细胞浓度调整至 20 × 10 6 个细胞/ml 。

微观ø的bservation我溶胶化Ñ体中性：Ç ytospin和w ^右的小号泰宁
添加5微升的嗜中性粒细胞溶液包含荷兰国际集团10个5从步骤A12到嗜中性粒细胞加入200μl的用PBS 10毫摩尔EDTA和移液管轻轻地混合。
对齐和组装细胞离心涂片漏斗，过滤器卡，载玻片，并cytoclip ，然后把它们放到细胞离心涂片器装置的细胞离心涂片器插槽。
将所有中性粒细胞混合物迅速转移到 cytospin 漏斗中，并在室温下以32 × g离心5 分钟。
解锁cytoclip和移除细胞离心涂片器的漏斗和过滤卡从玻璃载片上，以避免接触的细胞涂片。
风干载玻片š 2分钟。
添加1毫升的赖特的溶液到每个玻片孵育在室温下3分钟。
添加1米的纯化水（升）到所述赖特的溶液在每个载玻片上并孵育5分钟。
用 ddH 2 O冲洗载玻片1 分钟，并重复此步骤两次。
观察该载玻片小号与一光显微镜和计数的视图（大约300-400细胞在一个视图中）三个字段。甲- [R具有代表性图像示于图2。

图2.我溶胶化染色嗜中性粒细胞用赖特氏溶液和visualiz ED下一个光学显微镜。嗜中性粒细胞染色的细胞核与亚甲基蓝被细分为2-5叶，和它们的细胞质小号包含由曙红红染色的精细颗粒。嗜中性粒细胞的通过Polymorphprep分离的纯度TM是approximat Ë LY 95％-99％。100倍放大倍数。

微泡ř从闻稿吨reated Ñ体中性
补充的嗜中性粒细胞溶液小号从步骤A12与人AB血清（约50-150微升）以5％的的体积。
添加的肿瘤坏死因子α（400-600微升）的适当体积，以实现翅片50毫微克/毫升至Al浓度激活中性粒细胞，促进微泡释放。
在 37°C 的水浴中孵育 20 分钟以模拟体温并定期轻轻滚动试管。这可以防止中性粒细胞死亡。

分离米icrovesicles
移动从步骤C3解决两个新鲜LY灭菌1.5ml微量管中。
在 4°C 下以4,400 × g (Hettich 320R)离心15 分钟以去除任何大细胞体。
收集上清液，其含有微泡，小心地以不打扰颗粒和转移到两个新鲜LY灭菌1.5ml微量管中。
在 4°C 下以13,000 × g (Hettich 320R)离心2 分钟以去除血小板。
收集上清液并转移至两个新鲜LY灭菌1.5ml微量管中。
放置的上清液到超速离心管中其被密封以防止蒸发溶液。
注意：这将是超速离心的；然而，只有一个管将被使用，所以一个balanc ë需要管。我们使用了一个重 5.76 克的等效管。为了平衡管，添加RPMI 1640直到含上清液的管是相等的权重，以您的平衡管。
在 4°C 下以 100,000 × g (Optima XPN-100)超速离心60 分钟。产生的颗粒将含有中性粒细胞衍生的微泡。
小心取出的上清液（图3）和重悬沉淀在200μl的PBS中。转移沉淀到新鲜LY灭菌1.5 ml离心管并覆盖其用箔以保持它黑暗。
注意：新鲜LY分离的微泡可以立即使用，以测试由其它小区的微泡摄取。中号icrovesicles小号在-80℃tored应该被在一个月内使用用于分析蛋白质，RNA，脂质，或其它部件内容。

图3.隔离嗜中性粒细胞的微泡（NDMVs）在底部的超速离心管中。黑箭头表示的白色微泡颗粒。

纳米粒子追踪分析 (NTA)
设置NanoSight NS300硬件和软件使用以下参数：60小号长度视频小号为5与次一高LY敏感照相机水平，15在25℃下，侦探阈3，“水”的粘度，“自动”模糊大小，和“自动”最大跳跃距离。
从步骤D8 1000稀释新鲜NDMVs ×在无颗粒的PBS，以实现一个密度范围的10 6 -10 9个粒子/ ml。
吸的稀释溶液NDMV到一个1ml注射器，避免荷兰国际集团气泡。
将注射器钻入所述入口端口的的O形环顶板的激光模块和慢慢注入1毫升的NDMV溶液在15填充腔室，避免荷兰国际集团气泡生产。
将激光模块安装到主仪器外壳中，并连接内部的电源适配器。
启动NTA软件记录NDMVs布朗运动和analyz Ë的Ñ anoparticle运动自动地（图4）。

图5. N anoparticle跟踪分析（NTA）的结果为嗜中性粒细胞衍生的microv esicles（NDMVs）。A.突出显示白色粒子被捕获NDMVs在一个从图像一个记录的视频。B. 该图说明了从 100 到 1,000 nm的NDMV尺寸s的分布及其浓度s 。NTA显示NDMV 浓度为5.80 × 10 8 ± 2.34 × 10 7颗粒/ml（平均值±标准偏差）。

食谱

磷酸盐-缓冲ED盐水（PBS）
9 克/升氯化钠
0.24 克/升 KH 2 PO 4
0.2 克/升氯化钾
1.42 克/升 Na 2 HPO 4
用 HCl 将 pH 值调节至 7.4
注意：所有PBS用于实验应传递通过一个注射器过滤器，以获得无颗粒PBS。

致谢

这项工作是由Ratchadapiseksompotch基金的支持下，朱拉隆功大学，资助号CUGR63953002 ，以及骨关节炎和Musculoskeleton研究单位。董展得到朱拉隆功大学成立100周年基金和中国国家留学基金委博士奖学金和研究生海外研究经验奖学金的资助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

该研究方案符合赫尔辛基宣言中概述的伦理标准，并得到朱拉隆功大学医学院人类研究伦理委员会的批准（第 565/59 号）。在参与研究之前，所有研究对象都充分了解研究方案和程序。从所有参与者那里获得了书面知情同意书。

参考

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