材料和试剂

过滤纸
多模光纤（0.39 NA，高OH，200μm核心，波长范围：300-1,200 nm; ThorLabs，目录号：FT200UMT）
用于光遗传学实验的材料（表1）
1. 多模光纤（0.39 NA，高OH，200μm核心，波长范围：300-1,200 nm; ThorLabs，目录号：FT200UMT）
2. 1.25 mm陶瓷棒套圈，230μm（精密纤维产品，目录号：MM-FER2007C-2000）＆nbsp;
表1.用于光遗传学实验的材料的主要特征总结
注射插管（5 mm，26 gauge; Plastics One，目录号：C315GS-5 / SPC）
1毫升注射器（BD Sciences，目录号：309628）
Tygon管1/16“I.D。 1/8“O.D。和1/32“墙（美国塑料，目录号：57102）
铝箔（Alcan）
注意：陶瓷插芯选用金属插芯，以确保准确的光纤对准。
1.25 mm SM陶瓷开口套管，长6.60 mm（精密纤维产品，产品目录号：SM-CS125S）
注意：陶瓷开口套管选用金属开口套管，以确保准确的纤维对齐。
1.25 mm套圈防尘盖，白色（Precision Fiber Products，目录号：BCDC-1300-W）
Parafilm M（Pechiney塑料包装，目录号：PM-996）
棉签（The Lab Depot，目录号：394305）
C57BL / 6小鼠（The Jackson Laboratory，目录号：000664）
注意：使用此协议已成功训练男性和女性受试者（4周+年龄）和陌生人（<3周龄）。
AAV病毒（储存于-80°C直至使用，滴度为~10 11 至10 13 pfu / ml）
例如：AAV-CaMKIIα：eArchT3.0-EYFP（北卡罗来纳大学GTC矢量核心）
AAV-CaMKIIa-hChR2（H134R）-mCherry-WFRE-PA（北卡罗来纳大学GTC载体核心）。
牙科水泥（Stoelting Co.，目录号：51458）＆nbsp;
速度设置即时混合环氧树脂（LePage， http://www.lepage.ca/en/lepage-products/epoxy-glue/speed-set-instant-mix-epoxy.html ）
缝合套件（Ethicon，目录号：JJ489）
撕裂凝胶（诺华，https： //well.ca/products/tear-gel-liquid-eye-gel_17561.html?gclid=CjwKCAjw6-_eBRBXEiwA-5zHaVuKltJxR7GYDuMwgeSM5yh_3J6FSiTehp0ekoUOvym2ICm3-YjZTxoCIkoQAvD_BwE ）
聚维酮碘
盐水
70％乙醇＆nbsp;
过氧化氢
冰
镇痛药：Metacam（CDMV，连续三天每日注射5 mg / ml）

设备

Cleaver（Doric Lenses，目录号：B600-0002）
光纤剥线工具（ThorLabs，目录号：T12S21）
10μl移液器（SARSTEDT，目录号：90.1771.002）＆nbsp;
数字卡尺（ULINE Canada）
小鼠立体定位框架（Neurostar）＆nbsp;
异氟醚的麻醉系统（Kent Scientific Corporation，目录号：SOMNO-MSEKIT）
温度控制器（Sunbeam）
加热垫
手术工具，包括剪刀，镊子，手术刀（精细科学工具）
0.6 mm钻头连接到立体定位框架（RWD Life Science，目录号：78001）
双注射器输液泵（World Precision Instruments，目录号：SP200iZ）
10μlHamiltonGastight注射器（汉密尔顿，目录号：84875）
白噪声机（Marpac）＆nbsp;
光纤电缆，MM，200μm，0.39 NA，FC / PC-FC / PC（Thorlabs，目录号：M72L02）
光遗传学实验设备（表2）
1. 473 nm DPSS激光系统（Laserglow，目录号：R471003GX）
2. 532 nm DPSS激光系统（Laserglow，目录号：R531003GX）
3. 功能/任意波形发生器（BK Precision，目录号：4052）
表2.用于光遗传学实验的设备的主要特征总结
功率计，Si传感器，400-1,100 nm，500 nW-500 mW（ThorLabs，目录号：PM121D）
激光眼镜，180-532 nm（ThorLabs，目录号：LG3）＆nbsp;
Doric迷你立方体（Doric Lenses，目录号：B340-0204）
2个单声道光纤跳线（Doric Lenses，目录号：D202-2302）
45厘米宽x 20厘米长x 30厘米高的三室设备（ANY-maze）
8厘米直径x 17厘米高圆柱形线笼（ANY-maze）
高压灭菌器

软件

ANY-maze跟踪软件（Stoelting Co.， http://www.anymaze.co.uk/ ）

程序

光纤生成
1. 使用光纤剥离工具（图1）剥去多模光纤（直径200μm，0.39 NA）的~5 cm区段。＆nbsp;
  
  图1.光纤测量。 A.光纤穿过陶瓷插芯的示意图。光纤的长度（以mm为单位）取决于所需的靶向区域。将光纤的长度（6.4 mm）和套圈与颅骨之间的间隙（0.5 mm）添加到所需瞄准区域的Z坐标（表示为X mm）。 B.成品光纤的例子。
2. 使用切割刀切割剥离的多模光纤的一段，该光纤具有使用数字卡尺测量的适当目标长度[例如，长度= 6.4 mm（陶瓷套圈）+ 0.5 mm（套圈和颅骨之间的间隙）+所需目标深度由参考地图集（mm）确定（图2）。
  
  图2.光纤结构。 A.使用数字卡尺测量感兴趣的长度。在该示例中，目标区域的Z坐标是3.5mm。因此，光纤的总长度为10.4毫米（3.5毫米+ 0.5毫米+6.4毫米）。 B.使用切割刀切割适当的长度。 C.为了将光纤固定到陶瓷插芯上，在切割光纤的中间添加一滴环氧树脂。 D.将套圈推到环氧树脂滴上以将其固定到光纤上。
3. 使用环氧树脂将切割光纤的一端固定到陶瓷套圈（孔径230μm，外径1.25 mm）。
4. 让光纤干燥过夜。
5. 植入前高压灭菌光纤。＆nbsp;
6. 确认每根光纤的透射率。将功率计测量的激光功率直接从连接到光纤跳线的激光盒到连接到光纤跳线和光纤的激光盒进行比较。每根光纤的激光透射率必须> 75％用于植入。
准备手术
1. 将注射插管连接到Tygon管的一端，而另一端连接到1 ml注射器。
2. 将所需体积（2μl/小鼠）移液到一片封口膜上。
3. 通过使用1ml注射器缓慢吸出，向注射套管中注入病毒。完成后，将注射器从Tygon管上拆下。＆nbsp;
4. 将注射插管和Tygon管与病毒一起放在冰上，用铝箔覆盖。
  注意：在每只小鼠开始之前，注射插管应该充满病毒。带有病毒的管道应保持在冰上最多1小时。病毒等分试样应保存在干冰中。
病毒注射
1. 从家笼中取出小鼠（4-6周龄）进行手术，并在手术前将其放入未使用的笼子（单个容器）中约15分钟。
2. 将小鼠置于啮齿动物麻醉机的诱导室中（诱导率：4％异氟烷）并等待3分钟直至小鼠呼吸稳定。脚趾夹紧，以确保鼠标完全麻醉。
3. 将鼠标从诱导室转移到加热垫（设置在37°C）并将麻醉面罩连接到鼻子（维持率：2.5％异氟烷）。确保麻醉流速稳定，小鼠自然呼吸。＆nbsp;
4. 插入立体定位框架的耳杆，确保鼠标平行于框架的底板。在双眼上加入泪液凝胶（图3A）。
5. 用棉签涂抹70％乙醇清洁切口部位，然后用聚维酮碘，最后用70％乙醇重复。＆nbsp;
6. 用手术刀从前到后做一个水平切口，露出颅骨并标记前囟（图3A）。
7. 在棉签上使用过氧化氢来干燥暴露的头骨表面。
8. 使用钻头根据病毒注射部位所需的双侧坐标（AP / ML）标记颅骨。
9. 将含有病毒的注射插管定位到立体定位框架中并确保其连接到Hamilton注射器。
10. 在注射之前，将输注泵编程为以0.1μl/ min连续输注，直到可以通过眼睛观察到一滴病毒。
11. 使用滤纸去除小滴，并对输液泵进行编程，以0.1μl/ min的速度取出0.1μl空气（在输液插管尖端和病毒之间形成气泡）。
12. 一旦设置在立体定位框架上，用注射套管重新测量所需的坐标（AP / ML）（注射套管应直接位于钻头产生的颅骨上的标记上方）。
13. 降低输液套管，直到其尖端接触颅骨表面。
14. 对输液泵进行编程，以0.1μl/ min的速率注入0.1μl。在输注（先前从步骤C11产生的气泡）期间，将输注套管轻轻降低到适当的DV坐标。
15. 在输注病毒前等待2分钟，然后对输液泵进行编程，以0.1μl/ min的速率注入0.5μl病毒。注入后，将内部插管在放置前再放置5分钟。
16. 慢慢抬起插管（~0.1 mm / s）。取下后，用乙醇清洁内部插管的尖端。确保尖端未被堵塞，并重复步骤C10-C15进行双侧注射。
纤维植入
1. 病毒注射后，从立体定位框架中取出注射套管。确保带有病毒的注射插管和管道储存在冰上并用箔覆盖。
2. 使用钻头根据所需的双边坐标（AP / ML）标记颅骨。
3. 将可拆卸臂连接到立体定位框架，并使用封口膜将单根光纤固定在手臂末端（图3B）。
4. 设置完成后，用光纤重新测量所需的坐标（AP / ML）（光纤应直接位于钻头产生的颅骨上的标记上方）（图3B）。
5. 将光纤降低到适当的DV坐标。使用镊子轻轻剥离将光纤连接到手臂的封口膜。
6. 将立体定位臂远离光纤。
7. 重复步骤D3-D6以进行光纤的双侧植入（图3C）。
8. 一旦植入两根光纤，用牙科粘固剂固定两根光纤（图3D和3E）。
  注意：在光纤底部周围轻轻涂抹牙科粘固剂。使用手臂确保光纤保持在原位，直到牙科粘固剂干燥。
  
  图3.双侧光纤植入的立体定向手术。：一种。水平切口暴露头骨。 B.在植入之前，单个光纤固定在可移除臂上，在AP / ML坐标处具有封口膜。 C.使用可移除臂双侧植入的第二光纤。 D.双侧植入的光纤。 E.用牙科粘固剂固定的双侧光纤。
  注意：这些图中未显示麻醉面罩。
9. 用betadine缝合皮肤和清洁手术部位。注射适当的镇痛药并将鼠标放在单独的加热垫上1小时。确保小鼠在将其放回新笼子之前完全恢复。小鼠在手术后单独饲养以防止搏斗。监测手术后的健康状况（体重，水合状态，姿势/外观，鬼脸[Matsumiya 等，2012]和行为）至少7天。
三室社会方法测试
1. 在手术后恢复7天后，在实验前在测试室中处理小鼠3天，持续10分钟。确保老鼠能够舒适地进行揉搓，并通过家笼中的陶瓷套管将跳线连接到植入的光纤上。＆nbsp;
2. 准备2只与受试小鼠性别匹配的幼年野生型陌生小鼠（3-4周龄，以防止战斗）。单个房子每个陌生人的老鼠，测试前48小时。
3. 设置摄像头，照明（20 lux）和白噪声发生器（65 db）。
4. 使用70％乙醇彻底清洁三室装置。通过将两个空笼放置在外室中来设置三室装置，同时使中间室留空。
5. 在测试前24小时，将每只小鼠连接到接插线并允许3分钟的家庭笼子适应期，然后在三室装置内进行10分钟的探索。在两个适应期后，将鼠标归还到家笼。
6. 在测试前24小时，使陌生笼中的陌生小鼠习惯（图4A）10分钟。
7. 在实验当天，使用功率计测试532 nm和473 nm激光器的强度（确保两个跳线之间的功率输出一致）。
  
  图4.用于三腔室社交方法测试的设备。 A.用于放置少年陌生人进行测试的笼子。 B.三室社会进场装置，在两个外室上放置两个空笼。
8. 准备好进行测试时，将鼠标连接到接插线（然后连接到波形发生器）并允许3分钟的家庭笼子适应期，然后在三个中间室中再加上3分钟的适应期。腔室装置。＆nbsp;
9. 取下隔板，让鼠标自由探索三室（外室有2个空陌生的笼子）10分钟。
10. 在适应阶段后更换隔板，同时确保主体鼠标回到中心室1分钟。
11. 将第一个陌生人的鼠标放入两个空的陌生人笼子中的一个（陌生人在空笼中的位置可以在不同的主体之间进行平衡，确保通过软件记录此信息）。
12. 再次移除分区，让鼠标自由探索三个腔室5分钟。在手中并通过视频跟踪系统记录在笼子中嗅探陌生人鼠标与在另一个房间中空笼子所花费的时间。在这个社交阶段，可以应用光遗传学操作来测试感兴趣的电路在社交记忆编码中的作用。例如：＆nbsp;
  1. 对于表达ArchT的小鼠：连续5分钟地双峰递送532nm（15mW和~119.43mW / mm 2 ）绿光。
    注意：可以针对不同地区相应调整功率。
  2. 对于表达ChR2的小鼠：双侧递送473nm（20Hz，5ms脉冲宽度，6.5mW和~51.75mW / mm 2 ）蓝光30秒点亮，然后30秒点亮模式5分钟。
    注意：可以针对不同地区相应地调整脉冲频率/持续时间。＆nbsp;
13. 在社交阶段之后更换分区，同时确保主题鼠标回到中心室1分钟。＆nbsp;
14. 将第二个陌生人的老鼠放入空陌生的笼子里。
15. 取下分区，让鼠标再次自由探索三个腔室，持续5分钟。通过手动和视频跟踪系统记录嗅探新陌生鼠标与熟悉的陌生鼠标的时间。在该社会识别记忆阶段期间，可以应用光遗传学操作来测试记忆检索（参见步骤E12中的ArchT和ChR2条件）。
16. 在测试之后，在返回新的笼子之前将小鼠带到中间室。
17. 测试后48小时（最小），按照步骤E7-E16对同一组小鼠进行平衡测试（有/无光传递）。
  注意：在第一次测试后2-7天进行平衡行为测试。以前的研究表明，这种范式仅在测试后24小时内引发记忆（Okuyama 等，2016）。因此，48小时足以让小鼠重新测试。

数据分析

请参阅 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.04的补充信息0.073 。

记录所有阶段并使用具有ANY-maze的顶置相机自动分析。当受试动物定向其鼻子或在有线笼子中包含的陌生小鼠2cm内开始物理接触时，通过手动评分嗅探时间/直接接触来测量相互作用量（围绕有线笼子的2cm区域被定义为使用ANY-maze软件的区域）。手动将绳子上的攀爬从评分中排除。数据以偏好（％）表示，其基于在调查任一笼子的整个时间内调查目标笼子所花费的时间百分比来计算（图5）。
注意：通过手动评分的交互时间计算的偏好（％）通过ANY-maze相机软件跟踪系统确定的偏好（％）进行验证。此外，这种验证有助于解决潜在的“盲点”问题（即左上角或右下角）;因为人工评分可以弥补这些潜在的问题。

图5.为分析定义的区域。：一种。在三室社会进场设备中定义的区域。 B.计算在左侧或右侧区域调查目标所花费的百分比时间，表示为两个区域的总和。
注意：与他们最近遇到的（熟悉的）小鼠相比，野生型小鼠通常会表现出更高的偏好（％）。
图中的所有数据均以平均值±SEM表示，并通过独立样本 t - 测试，配对样本 t - 测试或ANOVA（单向，双向或重复测量-RM，在适当的情况下），然后进行事后Holm-Sidak的多重比较。 P ＆lt; 0.05被认为是显着的（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001）。

笔记

有关此协议的预期结果和更多应用的示例，请参阅原始出版物 https：/ /doi.org/10.1016/j.celrep.2018.04.073 。尽管该方案着重于抑制或激活神经元群体，但使用ArchT或ChR2，重要的是要注意用于抑制的替代系统如halorhodopsin（NpHR）也是有效的。

致谢

该项目得到了加拿大卫生研究院（CIHR）（MOP119421和PJT-155959，加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）（RGPIN341498和RGPIN-2017-06295）以及病童医院的资助。作者感谢Feng Cao在协议图像方面的技术帮助。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

伦理

所有实验程序均按照加拿大动物保护协会（CCAC）的指导方针进行，并经病童医院动物护理委员会和多伦多大学批准。

参考

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