材料和试剂

5毫升注射器（Dispovan）
60毫米组织培养皿（BD Falcon ®，目录号：353002）
10厘米组织培养皿（BD Falcon ®，目录号：353003）
6孔组织培养板（BD Falcon ®，目录号：353046）＆nbsp;
50毫升Falcon管（BD Falcon ®，目录号：352070）
15毫升Falcon管（BD Falcon ®，目录号：352096）
14毫升圆底聚丙烯管（康宁，目录号：352006）
1.5 ml微量离心管（MCT）（Tarson，目录号：50010）
0.2微米PVDF膜（Bio-Rad，目录号：162-077）
X光胶片（Carestream，目录号：6574958）
铝箔
细胞刮刀（HiMedia，目录号：TCP104）
无菌22 G针（Dispovan）
C57BL / 6雄性小鼠（通常6-8周龄）
鼠伤寒沙门氏菌菌株SL1344
RPMI medium 1640（Lonza，目录号：12702F）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10082147）
HEPES（1M）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15630080）
MEM非必需氨基酸溶液（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11140-050）
抗生素 - 抗真菌药（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15240-062）
丙酮酸钠（100 mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11360-070）
GlutaMAX TM 补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：35050-061）
DPBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14190-144）＆nbsp;
PBS，pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10010-023）＆nbsp;
胰蛋白酶-EDTA（0.05％）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25300-054）＆nbsp;
台盼蓝溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15250-061）＆nbsp;
小鼠M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）（eBiosciences，目录号：34-8983）
ACK（氯化铵 - 钾）裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：A10492-01）
蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
磷酸酶抑制剂（罗氏，目录号：4906837001）
Bradford试剂（Sigma-Aldrich，目录号：B6916）
TWEEN ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P9146）＆nbsp;
Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）＆nbsp;
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）＆nbsp;
脱氧胆酸钠（DOC）（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
Trizma ®碱（Tris碱）（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）＆nbsp;
氯化钠（NaCl）（西格玛奥德里奇，目录号：3014）
乙二醇 - 双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：3889）
脱水乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
庆大霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G1272）
硫酸链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S6501）
乙醇（默克，目录号：108543）
脱脂牛奶（BD Difco，目录号：232100）
LB肉汤（BD Difco，目录号：244620）
SS琼脂（HiMedia，产品目录号：M108）＆nbsp;
Laemmlisample buffer（Bio-Rad，目录号：161-0747）
ON-TARGETplus非靶向对照siRNA池（Dharmacon，目录号：D-001810-10）＆nbsp;
ON-TARGETplus Mouse Arl11 siRNA（Dharmacon，目录号：L-055672-01-0005）
多克隆抗总ERK1 / 2抗体（Cell Signaling Technology，目录编号：4695）
多克隆抗磷酸化ERK1 / 2抗体（Cell Signaling Technology，目录编号：4370）
过氧化物酶AffiniPure山羊抗兔IgG（H + L）（Jackson ImmunoResearch，目录号：111-035-144）
ECL Plus Western Blotting Substrate（Pierce，目录号：32132）
70％乙醇（见食谱）
完整的RPMI培养基（参见食谱）
小鼠M-CSF原液（0.4 mg / ml）（见食谱）
SS琼脂平板（见食谱）
链霉素原液（50 mg / ml）（见食谱）
LB肉汤（见食谱）
Opsonization缓冲区（参见食谱）
感染生长培养基（GM）（见食谱）
RIPA裂解缓冲液（见食谱）
阻塞缓冲区（参见食谱）
PBST（见食谱）
抗体稀释缓冲液（见食谱）

设备

烧杯
0.2微米聚醚砜滤料
剪刀和镊子（Fisher Scientific）
细胞培养CO 2 培养箱（Thermo Scientific，型号：371）
生物安全柜II级（ESCO，型号：AC2-4S8-NS）
倒置组织培养显微镜（尼康，型号：TS2）＆nbsp;
血细胞计数器（Sigma，目录号：Z359629）
多模阅读器（Tecan，型号：Infinite M200）
孵化器摇床（New Brunswick，型号：Innova 42）＆nbsp;
自动X光胶片处理器（Protec，型号：OPTIMAX 2010）
平板扫描仪（Microtek，型号：Bio-5000）
冷冻离心机带板式离心机桶，足以容纳6孔板（Eppendorf，型号：5810 R）
半干式水平吸墨系统（Atto，型号：WSE-4020）
SDS-PAGE凝胶装置（Bio-Rad，型号：Mini Protean Tetra Cell）
跳舞振动筛（Tarson，型号：MC-02）
摇摆摇床（Tarson，型号：4080）
流式细胞仪

软件

ImageJ软件（NIH， https://imagej.nih.gov/ij/ ）
Microsoft Excel软件（MS Office）

程序

该协议分为三个部分：A）小鼠原发性BMDM的产生; B）用鼠伤寒沙门氏菌感染BMDMs ; C）通过Western印迹评估感染沙门氏菌的巨噬细胞裂解物中活化/磷酸化水平ERK1 / 2。建议读者阅读图1所示的原理图，描述执行该协议的不同步骤。

图1.示意图，显示用于调查宿主因子在调节原发性骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）中ERK1 / 2激活中的作用的步骤鼠伤寒沙门氏菌感染。分离小鼠骨髓细胞并在M-CSF存在下培养以产生原发性BMDM。在产生BMDM后，用针对目的基因的对照siRNA或siRNA转染细胞。 siRNA后处理，用鼠伤寒沙门氏菌的调理固定相培养感染BMDM。在感染后的不同时间结束时，进行细胞裂解并在SDS-PAGE凝胶上运行裂解物，进行Western印迹并使用化学发光底物在X射线胶片上显示信号。使用ImageJ软件量化扫描的X射线胶片的信号强度。

生成小鼠原发性BMDMs
1. 准备三个60毫米组织培养皿，装满70％乙醇（见食谱1），DPBS或完整RPMI培养基（见食谱2），并在干净区域上放一对无菌（高压灭菌）镊子和剪刀，做好小鼠解剖准备在生物安全柜（BSC）内。另外，放置一块用70％乙醇清洗过的方形（12 x 12英寸）铝箔，作为鼠标解剖的平台。
  注意：在实验过程中始终保持无菌条件。
2. 通过颈椎脱位牺牲小鼠并将小鼠浸入含有70％乙醇的烧杯中。使用小剪刀的尖端在鼠标的大腿附近切割，并使用剪刀和镊子从每个后肢的顶部向下剥离皮肤。通过切割尾骨和股骨（沿着与股骨感觉90°的骨头切割）将后肢从身体上分离。切断脚（t骨）和皮肤并丢弃。将去皮的肢体保持在含有70％乙醇的培养皿中5分钟，因为这会使肌肉脱水，使其更容易脱离骨骼（见图2A-2G）。
  注意：为了防止BMDM培养物被肌肉和成纤维细胞污染，去除肌肉。
3. 使用剪刀去除四肢多余的肌肉，同时保持骨骼完整性。用剪刀轻轻按压以切断膝关节，切断股骨和胫骨之间的韧带（见图2H-2I）。将骨头置于70％乙醇中5分钟，然后将其转移至含有DPBS的培养皿中5分钟。
4. 使用一对镊子将骨骼保持在中心，并使用剪刀切割胫骨/股骨的两端（距端部约3-6 mm）。用完全RPMI培养基填充5ml注射器，并通过骨的一端将骨髓（BM）冲洗到含有完全RPMI培养基的60-mm组织培养皿中。重复此步骤穿过骨的另一端以从骨的两端排出BM（图2J-2K）。
5. 使用5ml注射器，将收集的BM通过22G针头3-4次以制备单细胞悬浮液，并将细胞收集在50ml Falcon管中（图2L-2N）。
6. 在室温（RT）下将细胞悬浮液在700μM离心5分钟，并倾析上清液。
7. 向细胞沉淀中加入1ml ACK裂解缓冲液以裂解RBC并继续轻微混合，孵育1分钟。立即加入10ml DPBS并在室温下以700×g离心离心细胞悬浮液5分钟（图2O）。
  注意：不要超过孵育时间超过1分钟，因为它可能会对RBC以外的细胞造成损害，并降低BMDM的总产量。
8. 如步骤A6中所述，使用10ml DPBS洗涤细胞沉淀两次。
  注意：加入DPBS观察肌肉污染情况。如果存在任何肌肉碎片，请使用1 ml移液器将其取出。
9. 最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于15-20ml完全RPMI培养基中，并使用台盼蓝排除原理在倒置组织培养显微镜下用血细胞计数器计数细胞。
  注意：BM细胞的产量变化很大，因此应使用台盼蓝的不同稀释度来获得准确的细胞计数。通常，可以使用1：100台盼蓝的起始稀释液，孵育时间为1分钟进行细胞计数。
10. 在10-cm组织培养皿中培养约4百万个BM细胞，该培养皿含有8ml补充有30ng / ml M-CSF的完全RMPI培养基（参见方法3）。将培养皿置于37℃和5％CO 2 的细胞培养箱中。将此步骤视为第1天。
11. 观察第2天粘附的巨噬细胞百分比的增加。
12. 在第3天，通过添加一半体积的最初使用的完整RPMI培养基补充BM培养物，即，4ml完全补充有M-CSF（30ng / ml）的RPMI培养基＆NBSP;
13. 观察第4天粘附的巨噬细胞百分比（约60％）的增加。
14. 到第5天，将观察到~90％粘附的巨噬细胞（图3）。要在功能实验中使用BMDM，请取出培养基，然后用10 ml DPBS轻轻洗涤细胞。要分离BMDMs，加入5 ml胰蛋白酶，将培养皿置于37°C培养箱中5-10分钟。孵育期后，快速查看显微镜下的细胞以确认脱离。接下来，通过添加5ml完全RPMI培养基进行胰蛋白酶中和。使用1 ml移液器吸头轻轻冲洗细胞，将细胞悬液转移到50 ml离心管中。
  注意：非常温和地执行步骤A14以避免激活巨噬细胞。
15. 在室温下将细胞悬浮液在700μM离心5分钟离心，轻轻重悬于10ml完全RPMI培养基中，并使用血细胞计数器进行细胞计数，如步骤A9中所述。
16. 在此步骤中，可以通过流式细胞术分析收集的细胞的巨噬细胞纯度，并准备进行进一步的表征和功能实验。
  注意：为了通过流式细胞仪分析分离的巨噬细胞的纯度，读者可以参考张等。，2008。
  
  图2.用于制备BMDM的小鼠解剖。 A.通过颈椎脱位处死6-8周龄的C57BL / 6雄性小鼠，并在70％乙醇中灭菌并置于干净的铝上生物安全柜内的铝箔。是。使用小剪刀在鼠标大腿附近切割，并使用剪刀和镊子将每个后肢顶部的皮肤从脚上剥下来。 F.通过切割尾骨和股骨，将后肢从身体上分离。 G.切断脚（t骨）和皮肤。 H和I.使用剪刀从肢体上去除多余的肌肉，并通过用剪刀轻轻按压以切断股骨和胫骨之间的韧带来小心地分离膝关节。 J和K.用镊子将骨头固定在中心，用剪刀剪掉胫骨/股骨的两端。 L-N。使用5ml注射器，将收集的BM通过22G针头3-4次以制备单细胞悬浮液并在50ml Falcon管中收集细胞。 O.离心并将ACK裂解缓冲液加入细胞沉淀中以裂解RBC。立即DPBS并离心细胞悬液以收集BM细胞。
  
  图3.小鼠BMDM的表征。在小鼠后肢分离的BM细胞在M-CSF存在下培养。在第5天，巨噬细胞群体很大程度上是粘附的。比例尺=100μm。
用鼠伤寒沙门氏菌感染BMDMs
1. 在6孔组织培养板中，在每孔含有30ng / ml小鼠M-CSF的2ml完全RPMI培养基中，以1×10 6个细胞/孔的密度接种BMDM。所需的6孔组织培养板的数量将取决于要进行的siRNA处理的数量和待分析的不同感染时间点。＆nbsp;
2. 第二天，用含有30ng / ml小鼠M-CSF的新鲜完整RPMI培养基替换培养基，并按照制造商的说明用对照siRNA和基因特异性siRNA转染BMDM。为了说明该方案，我们已经如Arya et al。，2018中所述进行了对照siRNA或Arl11 siRNA。
  注意：鼓励读者标准化条件即，siRNA的数量和治疗时间，以达到他们感兴趣的基因的最大沉默。＆nbsp ;
3. 为了制备感染的静止培养物，从含有50μg/ ml链霉素的新鲜条纹SS琼脂平板（参见食谱4和5）中接种3ml LB肉汤中分离的鼠伤寒沙门氏菌 SL1344菌株的菌落（见配方6）在14ml圆底聚丙烯管中补充链霉素（50μg/ ml）。建立一夜之间的文化
  （~16小时）在37℃的振荡培养箱（200rpm）中。该步骤可在siRNA处理BMDM后56小时开始，以便在沙门氏菌培养物准备好感染时完成siRNA处理的持续时间（72小时）。
  注意：鼠伤寒沙门氏菌 SL1344菌株对链霉素有抗性，在培养基中加入链霉素以防止任何其他污染物的生长。
4. 测量O.D.使用分光光度计在600nm波长下过夜沙门氏菌培养物（在LB肉汤中稀释至1/10）。转移相当于O.D.的细菌培养物的体积。在MCT中= 1（~10 9 活细菌）。检查示例计算以估算O.D.所需的体积。 = 1.
  示例计算：
  如果O.D。 600 1/10稀释的过夜细菌培养物= 0.33
  因此，在1 ml培养物中计算的O.D. 600 细菌将= 0.33 x 10 = 3.3
  细菌数量等于10 9＆nbsp; 1 ml，即，OD 600＆nbsp; = 1.0 < / em>
  因此，所需的细菌培养量=（1 /实际O.D. 600 ）x 1 ml =（1 / 3.3）x 1 ml = 0.303 ml
  将0.303 ml细菌培养物转移到新鲜的MCT中，加入0.697 ml LB肉汤，使体积达到1 ml。
5. 将稀释的沙门氏菌培养物在8,600 x g 离心3小时，在室温下离心，吸出0.9 ml LB肉汤并加入等体积的DPBS。通过温和涡旋重悬细菌细胞，再次重复离心步骤以除去LB肉汤。
  注意：离心1 ml后，仅吸出0.9 ml体积以防止细菌损失，并重复离心步骤两次，以完全去除LB肉汤。
6. 进行细菌的调理作用。为了有效地粘附巨噬细胞表面上的细菌和吞噬作用，细菌表面涂有血清中存在的IgG。在步骤B5完成后吸出0.9ml DPBS，并将细菌沉淀重悬于900μl调理缓冲液中（参见方法7）。将细菌悬浮液在37℃孵育20分钟，间歇反转混合，然后在8,600 x g 离心3分钟。轻轻吸出上清液（约0.9 ml）并加入0.9 ml DPBS重悬细菌细胞沉淀。
  注意：离心1 ml后，仅吸出0.9 ml体积，以防止调理细菌的损失。
7. 将调理后的细菌稀释至GM中的1/10（参见配方8），即，4.5ml GM（预热至37℃）+ 0.5ml调理细菌。这意味着，如果OD 600 = 1意味着1×10 9 细菌/ ml，那么1/10稀释将具有10 8 细菌/ ml。
  注意：步骤B6和B7应在单独的生物安全柜中进行，以尽量减少污染。
8. 在感染复数（MOI）50：1下感染来自步骤B2的接种的BMDM（即，在72小时siRNA处理后）。要执行此操作，请删除完整的RPMI介质并使用DPBS清洗一次。然后快速将0.5ml来自步骤B7的稀释细菌加入每个孔中。 MOI是感染期间每个细胞添加的细菌数量。请参阅示例计算以估算实现MOI为50：1所需的体积。
  示例计算：
  BMDMs在6孔组织培养皿中以每孔10 6 细胞的密度接种 > 因此，对于MOI = 50：1，所需的细菌数量= 10 6 x 50 = 5 x 10 7
  我们在1毫升中有108个细菌（如步骤B7）
  因此，对于5 x 10 7 ，需要的培养体积= 1 ml x 5 x 10 7 / 10 8 =每孔0.5 ml细菌稀释液。
9. 为避免BMDM对沙门氏菌的不均匀吞噬作用，通过在6孔组织培养板的每个孔中加入1.5 ml GM来同步该过程，用Parafilm密封板以避免溢出，并进行离心分离在30°C时453 xg
  5分钟。
10. 取出Parafilm并在感染后（p.i.）样品将板转移至37℃和5％CO 2 的细胞培养箱中20分钟。
通过蛋白质印迹评估沙门氏菌感染的巨噬细胞裂解物中活化/磷酸化水平ERK1 / 2
1. 从孔中吸出培养基以除去未内化的细菌，并用DPBS（1ml /孔）洗涤一次并完全除去DPBS而不移出细胞。＆nbsp;
2. 细胞裂解液的制备
  裂解未感染（对照）和20分钟p.i.样品加入冰冷的RIPA缓冲液，补充1x蛋白酶抑制剂和1x磷酸酶抑制剂（每孔0.1ml，6孔板）（参见方法9）。立即从平板上刮下细胞，将提取物转移到适当标记有样品名称的MCT中。保持在冰上。
3. 向剩余的样品孔中加入2 ml GM（补充50μg/ ml庆大霉素），并将板转移至37°C和5％CO 2 的组织培养箱中进行下一次根据您的实验要求的感染间隔。例如，对于50分钟p.i.样品，将样品充分孵育30分钟。在每次p.i.结束时，如步骤C2中所述制备细胞裂解物。
  注意：在培养基中添加庆大霉素是为了防止即使在洗涤后遗留下来的非内化细菌的生长，庆大霉素对巨噬细胞的细胞毒性也很小。
4. 将细胞裂解物保持在冰上最多10分钟（刮除后），然后在16,600 x g 4℃下离心10分钟。
5. 在新鲜的MCT中小心地收集后核上清液（PNS）而不干扰沉淀。如果要在第二天进行SDS-PAGE，PNS可以储存在-80°C。
6. 使用制造商的说明通过Bradford测定法定量PNS中存在的蛋白质浓度。将所有样品相对于彼此标准化以加载等量的蛋白质（每个泳道~15-20μg）。
7. 标准化后，计算每个样品所需的体积并转移至新鲜MCT并加入Laemmli样品缓冲液至终浓度为1x，在99℃下煮沸7分钟，然后短暂旋转。
8. 将样品加载到10％SDS-PAGE凝胶上并遵循标准Western印迹程序。
  注意：SDS-PAGE凝胶需要一式两份进行，因为针对p-ERK1 / 2和总ERK1 / 2的抗体检测到相同大小的条带。
9. 在进行蛋白质转移步骤（30伏在冷室中2小时）后，将PVDF膜在封闭缓冲液（参见配方10）中在4℃下在水平振荡器上孵育过夜。
10. 取出封闭缓冲液，用0.05％PBST洗涤膜三次，每次5分钟（见配方11）。＆nbsp;
11. 在抗体稀释缓冲液（0.05％PBST;参见配方12）中孵育膜和一抗（1：1,000稀释），在室温下温和搅拌2小时。
12. 在舞动摇床上用0.05％PBST洗涤膜三次，每次5分钟。
13. 将膜与山羊抗兔IgG（HRP-缀合的）抗体（1：5,000稀释）在0.05％PBST中孵育，在室温下温和搅拌1小时。
14. 除去二抗溶液并在舞动摇床上用0.3％PBST洗涤膜三次，每次10分钟。
15. 按照制造商的说明准备ECL试剂。用膜孵育ECL底物1分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露于X射线胶片并在自动X光胶片处理器中显影信号（图4）。
16. 使用平板扫描仪扫描显影的X射线胶片，并使用ImageJ软件对磷酸和总ERK1 / 2波段信号进行光密度定量，如下面的数据分析部分所述。
  
  图4.在感染沙门氏菌后，BMM中Arl11的消耗会损害ERK1 / 2活化。 Control-和Arl11-沉默的BMDM用鼠伤寒沙门氏菌感染不同的时间段，制备裂解物并用指定的抗磷酸-ERK1 / 2和抗-Ell-ERK1 / 2抗体印迹。

数据分析

使用ImageJ软件对磷酸和总ERK1 / 2信号进行光密度定量

1.启动ImageJ软件并打开磷酸化ERK1 / 2和总ERK1 / 2印迹的扫描图像，如图5A所示。转到“文件”→“打开”→“浏览”→“选择文件”→“打开”。
2.从ImageJ工具栏中选择“矩形工具”，然后绘制一个覆盖通道1中带状信号的框，如图5B所示。转到“分析”→“凝胶”→“选择第一道”。
3.将选择从第1道拖放到第2道，如图5C所示。然后转到“分析”→“凝胶”→“选择下一道”。重复此步骤，直到选中所有通道。
4.要获得每个波段的像素强度，请转到“分析”→“凝胶”→“绘制通道”。然后从图像J工具栏中选择“魔杖工具”，将光标（+）置于第1道的直方图中心，然后对下一个窗格重复此步骤，并用鼠标左键单击以获得峰值下的区域（像素强度））在一个单独的盒子中，如图5D所示。要执行此步骤，请确保选中“区域对话框”。要检查这一点，请转到“分析”→“设置测量”→“检查区域对话框”→点击“确定”。
5.对于每个感染时间点，将测量值复制到MS Excel Sheet中，检测磷酸化ERK1 / 2和总ERK1 / 2印迹。然后计算每次p.i的磷酸-ERK1 / 2与总ERK1 / 2信号的比率。并绘制一个聚类列图。有关更多信息，建议读者参阅Arya et al。，2018年的图4a和4b。

图5.使用ImageJ进行光密度定量。显示了使用ImageJ软件进行光密度定量的不同步骤的屏幕截图。有关详细信息，请参阅协议的数据分析部分。

食谱

70％乙醇
将70毫升无水乙醇与30毫升无菌蒸馏水（DW）混合
完整的RPMI媒体
RPMI 1640
10％热灭活FBS
10 mM HEPES
1 mM丙酮酸钠
1x抗生素 - 抗真菌药
1x MEM非必需氨基酸
1x GlutaMAX TM 补充说明
储存在4°C
小鼠M-CSF储备液（0.4 mg / ml）
0.5 mg M-CSF
1.25毫升PBS（pH 7.4）
使用0.2微米聚醚砜过滤器过滤灭菌，等分并储存在-80°C
注意：为了延长保质期（长达1年），在PBS（pH 7.4）中使用0.1％BSA作为溶剂。
SS琼脂平板
6.3克
100毫升DW
经常搅拌加热至沸腾以完全溶解介质。冷却至约45℃，加入所需浓度的抗生素，充分混合并倒入无菌培养皿中。将板保存在4°C
注意：不要高压灭菌或过热SS-Agar培养基，因为它会破坏培养基的选择性。＆nbsp;
链霉素原液（50 mg / ml）
0.5克硫酸链霉素
10毫升DW
过滤灭菌，等分试样并储存在-80°C
LB肉汤
2.5克LB混合物
100毫升DW
高压灭菌并在室温下无菌条件下储存
Opsonization缓冲区
DPBS中的20％FBS
GM感染
RPMI 1640
10％热灭活FBS
10 mM HEPES
1 mM丙酮酸钠
1x MEM非必需氨基酸
1x GlutaMAX TM 补充说明
储存在4°C
注意：在感染介质中不添加抗生素以防止内化细菌的停滞和杀灭。
RIPA裂解缓冲液
10mM Tris-Cl（pH 8）
140 mM NaCl
1 mM EDTA
0.5 mM EGTA
1％Triton TM X-100
0.1％DOC
0.1％SDS
在RT商店
注意：在立即使用前，将蛋白酶和磷酸酶抑制剂添加到RIPA裂解缓冲液中。
阻塞缓冲区
含0.05％PBST的5％w / v脱脂奶粉
PBST
PBS中TWEEN ® 20所需的百分比
通过搅拌充分混合并在室温下储存
抗体稀释缓冲液
初级和二级抗体稀释（根据抗体数据表）在0.05％PBST中制成

致谢

该方案根据先前发表的研究进行了调整和修改（Sindhwani et al。，2017; Arya et al。，2018）。作者感谢理事会和科学理事会的财政支持。印度工业研究（CSIR）。 A. Tuli承认Wellcome Trust /生物技术部（DBT）的财政支持。这项工作得到了授予A. Tuli的Wellcome Trust / DBT印度联盟中级奖学金的支持（IA / I / 14/2 / 501543）。 A. Tuli还承认CSIR-微生物技术研究所（IMTECH，Chandigarh）的基础设施和财政支持（OLP-144，第038/2018号来文）。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

伦理

本研究严格按照动物实验监督委员会（1094 55/1999 / CPCSEA）根据1960年“防止虐待动物法”和1982年由动物部颁布的修正案发布的指导原则进行。环境与森林，印度政府。涉及小鼠实验的所有方案均由科学和工业研究委员会 - 微生物技术研究所的机构动物伦理委员会批准（IAEC / 16/12批准）。

参考

Arya，S.B.，Kumar，G.，Kaur，H.，Kaur，A。和Tuli，A。（2018）。 ARL11通过促进丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号传导来调节脂多糖刺激的巨噬细胞活化。 J Biol Chem 293（25）：9892-9909。
Buscher，D.，Hipskind，R.A.，Krautwald，S.，Reimann，T。和Baccarini，M。（1995）。 Ras依赖和非依赖性途径靶向巨噬细胞中丝裂原活化蛋白激酶网络。 Mol Cell Biol 15（1）：466-475。
Epelman，S.，Lavine，K。J.和Randolph，G.J。（2014）。组织巨噬细胞的起源和功能。 Immunity 41（ 1）：21-35。
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