材料和试剂

移液器吸头（Eppendorf，目录号：022491083）
无菌离心管
玻璃盖玻片（通常分别为22 x 22 mm或22 x 50 mm，方形和矩形尺寸）＆nbsp;
培养皿（通常为100 x 21 mm或35 x 10 mm，基于实验设计，Thermo Fisher Scientific，USA）
96孔板或腔室载玻片
挫败
BD TM CS＆amp; T珠
JC-1染料（冻干）（MitoProbe JC-1 Assay Kit，Thermo Fisher Scientific，USA，目录号：M34152）
羰基氰化物3-氯苯腙（CCCP）（MitoProbe JC-1 Assay Kit，Thermo Fisher Scientific，USA，目录号：M34152）＆nbsp;
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（西格玛奥德里奇，目录号：D8537）
二甲基亚砜（DMSO）（MitoProbe JC-1 Assay Kit，Thermo Fisher Scientific，USA，目录号：M34152;或Sigma-Aldrich，目录号：D5879）
50 mM CCCP（溶剂：DMSO）
BD FC Bead 4c Plus研究套件
FC Bead 4c研究套件
FC Bead Violet研究套件

设备

移液器（Eppendorf）
恒温箱
建议使用微量离心机（例如，Sorvall TM Legend TM Micro 21R微量离心机）或类似仪器）（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM Legend TM Micro 21R），包括带有Click Seal的24 x 1.5 / 2.0 ml转子（生物防护，目录号：75002447）
流式细胞仪，配备488 nm氩激发激光器，设计用于检测罗丹明或德克萨斯红染料的带通滤光片（BD FACSCalibur System或类似平台）（BD，型号：FACSCalibur TM ）
有效的替代方案包括荧光显微镜（EVOS TM FL彩色成像系统，目录号：AMEFC4300）和双带通滤波器，设计用于同时检测荧光素和罗丹明或荧光素和德克萨斯红染料或荧光板阅读器（Synergy TM Mx Monochromator-Based Multi-Mode Microplate Reader-BioTek，目录号：236219）配有激光/荧光滤光片和黑色96孔板。

软件

FACSuite软件

程序

准备和设置
注意：首先，在使用前让JC-1粉末和DMSO溶液达到25°C。
1. 使用前立即准备新鲜的200μMJC-1染料储备液，用DMSO重新配制冻干的JC-1染料，得到100倍的储备溶液。＆nbsp;
2. 混合制剂直至溶液中没有聚集物，染料粉末完全溶解。
悬浮细胞的染色方案
以下方案描述了在悬浮液中培养细胞上使用JC-1染料的制备步骤，然后通过流式细胞术，荧光显微镜或荧光板读数器分析细胞制备。
1. 基于实验设计，将细胞接种在明胶包被的细胞培养瓶或玻璃室载玻片上，在温热的培养基中培养并保持在37℃，5％CO 2 暴露。每隔一天更换培养基直至细胞达到融合。
2. 从烧瓶或玻璃室载玻片上分离粘附的细胞。
  1. 简而言之，通过抽吸从培养容器中取出培养基，然后将足够的胰蛋白酶或胰蛋白酶/ EDTA溶液分配到培养容器中以完全覆盖单层细胞，然后置于37℃培养箱中约6分钟。＆nbsp;
  2. 除去胰蛋白酶或胰蛋白酶/ EDTA溶液，将其加入含有等量温热细胞培养基（~37°C）的无菌离心管（15 ml）中，在25°C，125 xg离心7分钟。 /em>.
  3. 然后通过抽吸从管中取出培养基。
3. 为了将细胞悬浮在试管中，对于每个样品，加入1ml温热的细胞培养基（~37℃），PBS或另一种不超过1×10 6 细胞/ ml的缓冲液。
4. 通过向每个含有细胞的管中加入2ml温PBS（~37℃）或另一种缓冲液洗涤细胞，并在25℃，400μlg/ g离心5分钟。
5. 去除上清液。
6. 将细胞沉淀再次悬浮于1ml新鲜细胞培养基或PBS（~37℃）中。
7. 加入10μl200μMJC-1染料（终浓度为2μM）并在37℃，5％CO 2 下孵育细胞15-30分钟。然后按照步骤B8和B9的步骤制备阳性对照。
8. 在其中一个样品制剂中诱导细胞凋亡，将其作为剩余样品的阳性对照。＆nbsp;
9. 为了提供阳性对照，将1μl50mM CCCP（终浓度为50μM）加入到含有1 ml温热细胞培养基（~37°C），PBS或其他缓冲液的一个无菌离心管（1.5 ml）中不超过1×10 6 细胞/ ml，并在37℃下孵育5分钟。＆nbsp;
10. 通过向每个管中加入2ml温PBS（~37℃或另一个缓冲液）并在25℃，400 x g 下离心5分钟来洗涤所有样品。＆nbsp;
11. 去除上清液。＆nbsp;
12. 将细胞沉淀再次悬浮于300μl新鲜细胞培养基或PBS（~37°C）中。
13. 在完成最后一步后立即开始观察和测量，使用以下方法之一，包括如下所述的流式细胞术，荧光显微镜或荧光板读数器分析。通常，对于每个样本，重复次数应为n = 3，每个样本的观察和测量次数应大于5次。＆nbsp;
单层细胞的染色方案
以下方案描述了培养细胞单层中JC-1染色的过程，并使用荧光显微镜或荧光板读数器进行分析。
1. 细胞可以在预先涂覆的玻璃盖玻片（在培养皿中），96孔板支撑物或腔室载玻片上培养。确保不超过~1×10 6 细胞/ cm 2 的最大细胞密度。
2. 预涂层（试剂和密度）取决于所用的细胞。请参阅您的特定细胞培养方案。
3. 取出细胞培养基，然后用温热的培养基（~37°C），PBS或其他缓冲液替换。
4. 通过加入温PBS（~37℃）或另一种缓冲液洗涤细胞一次，再加入新鲜的细胞培养基或PBS（~37℃）。
5. 加入2μM（终浓度）的JC-1染料，并在37℃，5％CO 2 下孵育细胞15-30分钟。
6. 对于阳性对照，加入50μM终浓度的CCCP，并在37℃下孵育细胞5分钟。
7. 取出所有样品的培养基，加入温热的PBS或其他缓冲液（~37°C）洗涤细胞一次。＆nbsp;
8. 将PBS加入样品中（取决于培养平台和所选择的检测方法，将约100μl加入到96孔板中的每一个中或在培养皿或腔室载玻片中的相应量）。用一张铝箔覆盖，以保持培养平台及其内容不受光照。＆nbsp;
9. 立即分析测试培养物（包括对照）的荧光。有关量化方法，请参阅注释A.

数据分析

ΔΨM 的主要作用是使用氧化磷酸化来驱动ATP合成。保持电子穿过电子传输链以保持最佳电化学梯度的ΔΨM 的大小由ATP的产生与其消耗之间的平衡决定。增加的ATP产生或线粒体功能障碍可导致线粒体膜电位降低（Suski 等。，2012; Logan et al。，2016）。 JC-1作为荧光阳离子羰花青染料在线粒体中显示出潜在的依赖性积累，其形成J聚集体并且在去极化时扩散穿过线粒体以形成单体状态（图1）。
＆NBSP;作为一个研究实例，我们显示了我们以前发表的与脑微血管内皮中烟草烟雾（TS）和电子烟（e-Cig）毒性相关的研究数据（Kaisar et al。，2017 ; Prasad et al。，2017）。已经充分证明，吸烟导致血管内皮功能障碍的原因和剂量依赖性方式主要与活性氧（ROS）的含量有关（Kaisar et al。，2018）。在该研究实施例中，假设通过诱导线粒体去极化部分促进TS暴露对BBB内皮的有害细胞作用。我们还假设接触e-Cig可能会导致类似的结果。如前所述，我们首先建立了用CCCP（一种有效的线粒体膜破坏剂）处理培养细胞的阳性对照（用作比较术语）。然后我们使用荧光阳离子JC-1染料分析了TS和e-Cig对线粒体ΔΨM 的影响。结果显示急性暴露于TS和e-Cig促进原代脑膜内皮细胞（mBMEC）中的线粒体去极化，然而，与TS相比，e-Cig对线粒体去极化的影响明显不那么严重（参见实施例图2）。因此，数据显示响应于与线粒体去极化相关的TS和e-Cig暴露的红色（~590nm）至绿色（~529nm）荧光强度比降低，这在荧光图像中可清楚地观察到。结果还表明，e-Cig的影响不如TS严重。这些数据是作为线粒体ΔΨM 变化的定性和定量测量的一个方便的例子，可以使用JC-1染料进行评估。

图1.描绘JC-1进入线粒体和J聚集体生成的示意图。 JC-1，一种阳离子羰花青染料（绿色）在线粒体中开始形成J的潜在依赖性积累聚合（红色）;在去极化时，它仍然是显示绿色荧光的单体。

图2.使用JC-1模具评估线粒体去极化：一个实际的例子。急性暴露于TS后红色（~590 nm）/绿色（~529 nm）荧光强度比的减少是指示原发性mBMEC和bEnd中线粒体膜的去极化/破坏。还要注意JC-1染色如何允许并排比较不同实验处理（TS对e-Cig）对不同细胞类型的线粒体ΔΨM 的影响。实际上，请注意初级mBMEC和bEnd.3对同一治疗的反应有何不同。 CCCP =羰基氰化物3-氯苯腙，线粒体膜电位破坏剂。 * P ＆lt; 0.05; ** P ＆lt; 0.01; *** P ＆lt; 0.01，**** P ＆lt; 0.001与对照相比。 N = 3个生物学重复。

笔记

流式细胞仪，荧光显微镜或荧光板读数器分析的注意事项
关于光电倍增管（PMT）电压设置，不同的细胞仪工作方式不同。在我们的特定情况下，我们使用了BD FACSVerse，它通过FACSuite软件运行，并通过运行BD TM CS＆amp; T珠进行校准。
＆NBSP;在每次实验之前运行CS＆amp; T珠子是必要的，以提供标准化方法来执行仪器的光学，电子和流体的质量控制，以及调整荧光补偿和检测器电压。 FACSVerse具有9种荧光染料的自动补偿功能。通过运行BD FC Bead 4c Plus研究套件，FC Bead 4c研究套件，FC Bead Violet研究套件，每月更新自动补偿功能。
＆NBSP;通过将控制单元放置在点图的中心来确定PMT电压的值，参见下面的FSC / SSC图（图3A）。
＆NBSP;为了找到FL1-FITC / FL2-PE或APC PMT的电压，未染色的细胞被置于LL上，并且在柱状图上约为0（参见图3B，3C和3D）。虽然FACSVerse会自动进行补偿，但仍然需要确保补偿是正确的。

图3.流式细胞术检测。 A和B.通过流式细胞术门控策略（点图）基于两个散射参数区分细胞。 C和D.细胞计数基于指定的标记（对数直方图）。

流式细胞仪定量
在包含少量细胞和异质细胞群的小样本体积上，流式细胞术允许以高灵敏度分析细胞大小，其内容，频率和这些染色细胞的强度。建议在完成上述步骤B10之后立即开始通过流式细胞术进行分析。流式细胞仪必须配备488 nm氩激发激光器，检测信号的光电倍增管（PMT）值必须在FL1设置为390 V，FL2设置为320 V，FL2-FL1补偿约10.6％，而FL1- FL2补偿应约为4.0％（Cossarizza和Salvioli，1998）。凋亡细胞中含有绿色JC-1单体的线粒体可在FL1通道（FITC，GFP）中检测到，而健康细胞中的红色荧光JC-1聚集体将在FL2通道（PE，R-PE，RD1）中检测到。
＆NBSP;使用波长为488nm的氩激光激发JC-1染料。 JC-1聚集体和JC-1单体均显示绿色荧光（在527nm处的峰值发射），其在FL1通道（530nm）中测量，然而，JC-1聚集体也显示红色荧光（在590nm处的峰值发射）在FL2通道（585nm）中检测和测量。因此，在FL1和FL2通道中都会检测到健康的非凋亡细胞，FL1通道中的凋亡细胞将保持明亮，但是，FL2强度会降低。
＆NBSP;最后，确定红色荧光的比例除以绿色荧光的比率。对于流式细胞术，将根据荧光强度分析和分离10,000个细胞。

荧光显微镜评估
荧光强度检测是荧光团在较高能量和较小波长的光激发时发射的光的测量。样品由光源产生的光激发，并通过过滤器或单色器在特定波长下过滤。
＆NBSP;进行良好的定量荧光显微镜实验，目的是用数字定义感兴趣的事件或对象，其最常表示与空间或时间测量相关的荧光强度。该过程需要荧光显微镜和使用“双带通”滤波器。在凋亡细胞和死细胞中，染料看起来是绿色的，在530nm处发射，保持其单体形式，而在活的非凋亡细胞中，线粒体在590nm处聚集JC-1染料后将呈现红色。最后，评估显微镜拍摄的图像，找出红色荧光与绿色荧光的比例。对于荧光显微镜定性，并且没有通过显微镜进行定量测量。通常每张样本拍摄十张照片。

荧光板读数器定量
荧光板读取器的工作原理与荧光显微镜非常接近，尽管平板读数器仅记录总荧光，并且与基于板读取器的测定相比，荧光显微镜的分辨率和灵敏度也是优越的。将300μl细胞悬浮液转移到黑色96孔板的三个孔中（每孔100μl）。然后，使用荧光板读数器测量激发（550nm）/发射（600nm）和绿色荧光激发/发射（485nm / 535nm）中的红色荧光。然后，确定红色荧光的比率除以绿色荧光的比率。对于荧光板读数器，每个样品可以运行三次。
程序建议和故障排除的注意事项
1. 由于JC-1染料对温度和pH的变化非常敏感，因此所有试剂必须保持在25°C并在实验过程中仔细检查pH（7.4）。
2. 由于JC-1的光敏性，染色程序必须在没有直接强光的情况下进行，并在黑暗中孵育。
3. 由于分离的凋亡细胞可能在培养基中，因此在根据生物废物处理方法用新鲜培养基替换培养基后要小心如何处理培养基。
4. 处理JC-1染料时务必戴手套。
5. 基于可用的设备以及细胞的种类，可以选择每种定量方法。例如，一些细胞天然存在于体液中的悬浮液中，并且不附着于表面，例如血流中发现的造血细胞来源的细胞。此外，培养悬浮细胞比贴壁细胞培养更容易，因为悬浮细胞不需要胰蛋白酶消化，因为它们已经自由浮动。
6. 强烈建议立即用流式细胞仪，荧光显微镜或荧光板读数器分析样品。否则，保持样品冷藏（未冷冻）并在黑暗中保存一段时间（不超过24小时）。
7. 用JC-1染料染色的方案不需要很长时间（约30分钟）。持续时间取决于要分析的样品数量。
8. 如果细胞未使用JC-1染色良好，那么染色溶液可能已被离心，或染色的细胞已暴露于强光下。不要离心JC-1染色溶液。洗涤后立即分析染色的细胞，如果需要，增加JC-1染料的量。＆nbsp;
9. 细胞可以用多聚甲醛或其他固定剂固定，并储存在冰箱中直至JC-1染色。但在JC-1染色期间不要包含任何固定剂。
10. 如果细胞过度染色，则减少JC-1染料的量，并使细胞与游离PBS JC-1染料保持一段时间。这将有助于达到适当的分布均衡。
11. 如果未经处理的对照细胞显示红色与绿色信号的低比率，则可能损害对照细胞的活力。
12. 密度高于10 6 / ml的培养细胞可促进自然凋亡。
13. 由于细胞类型和培养条件的差异，初始步骤可能需要修改和调整。＆nbsp;
14. 用于最佳染色的JC-1染料的浓度可根据应用而变化。建议开始测试浓度范围约2μMJC-1染料。＆nbsp;
15. CCCP控制应用于确认JC-1染料对膜电位变化的敏感性。

致谢

资助：这项工作得到了美国国立卫生研究院/国家药物滥用研究所2R01-DA029121-01A1和ARDF对Luca Cucullo博士的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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