材料和试剂

1毫升移液器吸头（海门摩尔德实验室设备厂，产品目录号：20180411）
培养皿，直径35毫米（康宁，目录号：430165）＆nbsp;
亚克力板材（Donchamp科技，厚度：2.5 mm）
1.5毫升Eppendorf管（海门摩尔德实验室设备厂，目录号：20180315）＆nbsp;
标记笔（Genvana Industrial Development
透明胶带（小观树石集团）
尼龙网（上海旭红筛网，型号：100目）
塑料托盘（220 x 160 x 60 mm，长x宽x高）（金圆一日用百货皮发）＆nbsp;
Canton-S fly（由冷泉港实验室提供）
氰基丙烯酸酯胶502型（广东艾比达胶粘剂）
无水氯化钙（CaCl 2 ）（国药化学试剂，CAS号：10043-52-4）
乙醇溶液（北京化工厂，目录号：112412038320131）
玉米粉（北京首航国力贸易有限公司）
酵母（AB MANRI公司）
琼脂（北京中升万达生物科技有限公司）
蔗糖（国药化学试剂，目录号：10021418）
葡萄糖（北京北华精细化工有限公司）
山梨酸钾（宁波旺龙科技有限公司）
飞食（见食谱）

设备

孵化器（宁波江南仪器厂，型号：HWM-80）
录像机（索尼，型号：HDR-CX405）
立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZ61）
电钻（Dremel，型号：LITHIUM-10N）
CO 2 flypad（北京怡然机械加工厂，型号：50 mm x 30 mm）
LED阵列（北京飞武振兴电子，型号：LD-53404CWC03-A）
储存室（265 x 200 x 170 mm，长x宽x高）（北京西天龙塑料制品）
食品瓶（直径32毫米，高80毫米）（江苏海门杰宇实验仪器厂）
培养瓶（直径48毫米，高100毫米）（江苏海门杰宇实验仪器厂）

软件

MATLAB（MathWorks，R2013a）
Prism 5.0（GraphPad软件）

程序

室的构建和测定组分的制备（图1）
1. 剥夺水的菜
  1. 在培养皿盖上打一个洞
    使用35毫米培养皿的盖子使室内的水分被剥夺苍蝇。用电钻在每个盖子的侧面打一个4毫米直径的孔。＆nbsp;
  2. 用尼龙网覆盖培养皿盖（图1A）
    切一圈比培养皿盖略大的尼龙网（100目）。在盖子边缘均匀涂抹502胶水，然后用重物将盖子压在尼龙网上至少15分钟。
  3. 清洁成品菜肴
    为了消除胶水气味，用蒸馏水洗涤所得的实验皿三次，并在通风空间中干燥至少五天，然后再进行实验。
  图1.用于剥夺水分的实验培养皿。 A.用于剥夺水分的培养皿顶视图的照片。 B.用于剥夺水的盘子侧视图的照片。 C.用于除水的实验皿的尺寸。
2. 用于剥夺苍蝇的干燥室的构造（图2）
  1. 制作干燥的盒子
    将600g无水CaCl 2，放入塑料托盘（220×160×60mm，L×W×H）中。
  2. 切割亚克力板
    切割一块亚克力板，覆盖含有CaCl 2 （240 x 180 x 3 mm，长x宽x高）的塑料托盘。
  3. 建造干燥室
    将带盖的塑料托盘转移到储存室（265 x 200 x 170 mm，长x宽x高）。
  图2.用于除水的干燥室无水氯化钙（600 g）包含在有盖的塑料托盘中，该托盘保存在储存室中。
制作湿度板（图3）
1. 在亚克力板上钻孔
  使用厚度为2.5毫米的丙烯酸板制作湿度板。将片材切成300 x 200 mm的矩形片。在每个板上钻10个9毫米的孔（确保孔之间的距离至少为70毫米，如图3B所示）。
2. 连接Eppendorf管盖以包围孔
  从1.5毫升Eppendorf管中取出盖子。在这些盖子上涂上502胶水，然后将它们压在丙烯酸板上以包围孔，持续5分钟。在下一步之前将纸张保留过夜。
3. 在湿度板上标记实验盘的位置
  当Eppendorf管帽紧紧粘附在丙烯酸板上时，使用标记笔以每个孔为中心绘制直径为40 mm的圆。
4. 清洁湿度板
  为消除胶水气味，请用蒸馏水清洗湿度板三次，并在通风处干燥至少五天，然后再进行实验。
图3.湿度板。：一种。计划湿度板的照片的视图。 B.具有尺寸的湿度板图。 C.具有尺寸的湿度板的一个孔的图。
苍蝇的准备
1. 飞股票
  在12:12小时光照/黑暗循环下保持25°C和60％RH的苍蝇。羽化后4-7天使用成年果蝇进行卫生分析。
2. 飞饲料
  为了保持适当的种群密度，将20只雌性和10只雄性野生型果蝇转移到培养瓶（直径48毫米，高度100毫米）中，让雌性产卵两天;然后丢弃成年果蝇。
3. 准备用于行为测试的苍蝇
  将20只雄性（或雌性）果蝇在立体显微镜下的CO 2 飞行垫上收集到新鲜食物小瓶（直径32mm，高度80mm）中。在测试前，在12:12小时光照/黑暗循环下将收集的苍蝇在25°C和60％RH下保持在食物小瓶中两天。＆nbsp;
缺水（图5）
1. 将苍蝇转移到禁水菜中
  将20只苍蝇从食物瓶中轻轻移入带有吸管的1 ml移液管的尖端（图4），然后通过其侧孔轻轻将苍蝇吹入剥水盘中。用透明胶带密封孔。
  
  图4.吸管。吸管顶视图的照片，用于从培养管转移到剥水盘中的飞蝇。
2. 将实验皿转移到干燥室中
  将装有苍蝇的除水盘轻轻放置在干燥室中的丙烯酸板上，尼龙网朝上（图5A）。
3. 将干燥室置于培养箱中
  通过关闭盖子密封干燥室。将干燥室转移到25℃和60％RH的培养箱中（图5B）8小时。
图5.缺水程序。 A.在干燥室中用100目尼龙网覆盖的缺水盘的示意性侧视图。 B.在干燥室中装载有苍蝇的剥水盘的照片。 C.孵化器中干燥室的照片。
果蝇的卫生行为观察
1. 设置测试环境
  在行为实验之前，将室温设置为24±1°C，将湿度设置为40-60％RH。
2. 在湿度板上加水
  将湿度板放在水平表面上。加入200μl蒸馏水填充板上的每个盖子，使板在室温（24±1℃）下平衡30分钟。
3. 苍蝇的环境适应性
  除水后，用干燥室中的苍蝇轻轻取出实验皿。让苍蝇（仍然在他们的餐具中）适应实验环境，包括温度（24±1°C），湿度（40-60％RH）和照度（我们使用一系列白色LED作为光源， 800-850勒克斯）15分钟。
4. 记录寻水行为（见视频1）
  打开录像机并将焦点调整到湿度板的顶部表面;然后开始录音。将实验盘轻轻放在湿度板上，尼龙网面朝下。将实验培养皿与含水帽的中心逐一对齐。录像机在一个湿度板上监视十个菜肴。将最后一道菜放在湿度板上5分钟后关闭录像机。
  注意：对照组（没有缺水的苍蝇）和实验组（带有水的苍蝇）应放在同一湿度板上。
  视频1.记录寻水苍蝇。左菜包含缺水的苍蝇。正确的菜包含水合苍蝇。视频以正常速度的四倍播放。
清洁实验餐具和房间
干燥室应在使用后用蒸馏水和/或稀乙醇溶液（70％）洗涤。除水盘应仅用蒸馏水清洗。我们强烈建议在处理剥夺的餐具和房间时戴上手套，以防止转移不需要的气味。

数据分析

为了量化潮湿行为，我们在培养皿的中心定义了一个直径为17.5 mm的圆形区域，并计算了该区域在不同时间点的苍蝇数量（图6）。使用MATLAB中编写的脚本如下计算“潮湿指数”。
首先，我们在测试期间的不同时间点计算了hygrotaxis值。使用下式计算潮湿度值：

Hygrotaxis值（HV t ）=（N t - N 0 ）/ N sum

哪里，
N t ：此时定义区域内的苍蝇数量; N 0 ：实验开始时该区域的苍蝇数量; N sum ：菜中苍蝇的总数。在我们的测试中：N sum = 20.
潮湿指数定义为在5分钟测试中以5秒间隔测量的所有聚集值的平均值{hygrotaxis指数=（HV 5s + HV 10s + HV 15s + ... + HV 300s ）/ 60}。
注意：对于位于内圈的苍蝇，如果头部飞向内侧，则苍蝇被认为是在内圈。

图6.口渴的果蝇表现出潮湿的行为。：一种。用于量化潮气反应的区域图，用于计算潮湿指数。将培养皿置于含水孔上方，在尼龙网和水表面之间留出2.5mm的间隙。 B.照片显示了零时间苍蝇的分布情况。 C.三十秒后，脱水的苍蝇迅速迁移到水源之上并聚集在水源之上。
将Hygrotaxis指数数据输入Prism进行统计分析和图形可视化。计算不同实验组之间的潮气反应差异的统计学显着性。未配对的 t - 测试用于比较水合和脱水蝇的潮湿指数的差异（图7）。

图7.果蝇中的潮湿行为的定量。野生型蝇（ Canton-S 菌株）的潮湿指数大大增加）剥水8小时后。方块的中间线代表分布的平均值，方框表示分布的25％-75％，点代表一个实验的平均潮湿指数（超过5个菜）。

的食谱

飞食（1升，pH 7.2-7.4）
77.7克玉米粉
32.1 9克酵母
5克琼脂
0.726克CaCl 2
31.62克蔗糖
63.2克葡萄糖
2克山梨酸钾

的致谢

这项工作得到了国家自然科学基金（31771173）的支持。

竞争利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

<强>参考

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