材料和试剂

材料
1. 移液器吸头（Sharlab，目录号：00PC1000-1）
2. 1.5毫升Eppendorf管（Sharlab，目录号：027200400P）
3. T-175烧瓶（175 cm 2 ）（Corning，目录号：431466）
4. T-75烧瓶（75 cm 2 ）（Corning，目录号：431464U）
5. 15毫升离心管（Corning，目录号：430791）
6. 50毫升离心管（Corning，目录号：430828）
7. 96孔板（康宁，目录号：353072）
8. 24孔板（康宁，目录号：3524）
9. 5毫升聚苯乙烯圆底管（康宁，目录号：352052）
10. Cryovials（康宁，目录号：430489）＆nbsp;
11. 0.22μm注射器过滤器NML plus（Minisart，目录号：17823）
12. Stericup ®（Merk Millipore，型号：SCVPU02RE）＆nbsp;
13. 细胞过滤器40和100μm（康宁，目录号：352360）＆nbsp;
14. Luer 10 ml注射器（Braun，目录号：4606108V）
细胞
1. D1间充质干细胞（D1MSC）（ATCC，目录号：CRL12424）
2. 小鼠成肌细胞（C2C12）（ATCC，目录号：CRL1772）
试剂
1. 液氮（空气液体）
2. 反渗透水（Merck Milli Q系统，目录号：7003/7005）
3. Dubelcco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（GIBCO，目录号：D8537）
4. 含有Ca 2 + 和Mg 2 + 的DPBS（Lonza，目录号：17-512F）
5. 胰蛋白酶0.25％（GIBCO，目录号：25200056）
6. 甘露醇（西格玛，目录号：M4125）
7. 氯化钙（Sigma，目录号：C4901）
8. 超纯低粘度和高葡萄糖醛酸海藻酸盐（LVG）（Novamatrix，目录号：BP-1410-19）
9. 柠檬酸钠（柠檬酸三钠二水合物）（Panreac申请，目录号：141655.1211）
10. D1MSCs培养基（ATCC，目录号：DMEM 30-2002）
11. C2C12培养基（Gibco，目录号：DMEM 11960）
12. 胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：42G9273K）
13. 抗生素/抗真菌药（Gibco，目录号：15140-122）
14. 二甲基亚砜（DMSO）（ATCC，目录号：A503039）
15. 低分子量透明质酸30-50 kD（LMW-HA）（Contipro，目录号：9067-32-7）
16. 细胞计数试剂盒-8（Sigma，目录号：96992-500TESTS-F）
17. LIVE / DEAD TM 活力/细胞毒性试剂盒（488/570）（Invitrogen，目录号：L3324）
18. Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（Sigma，目录号：APOAF-50TST）
19. D1MSC完全培养基（见食谱）
20. C2C12完全培养基（见食谱）
21. DMSO 10％CPA溶液（参见食谱）
22. LMW-HA 5％CPA解决方案（参见食谱）
23. 1％甘露醇（见食谱）
24. 55 mM氯化钙（见食谱）
25. 1％柠檬酸钠（见食谱）
26. 1.5％藻酸盐LVG（NovaMatrix）（见食谱）
27. 钙黄绿素/乙锭染色溶液（用于显微镜检查）（见食谱）
28. 钙黄绿素/乙锭染色溶液（用于流式细胞仪）（见食谱）

设备

无菌抹刀（Sharlbab，目录号：3100000BOC）
移液器2-20μl，20-200μl，100-1,000μl（Eppendorf，目录号：4924000916）
CoolCell ®细胞冷冻容器（无酒精控制率-1°C / min细胞冷冻容器）（Corning Biocision，目录号：BCS-405）
-80°C冰箱（Thermo Fisher，目录号：TSX40086A）
TC20 TM 自动细胞计数器（Bio-Rad，目录号：145-0101）
37°C水浴（Memmert，目录号：WNB 45）
层流罩（Burdinola，目录号：AH-100）
离心机Mixtasel-BL（Selecta，目录号：7002575）
CO 2 培养箱（三洋，目录号：MCO-20 AIC）
冰箱（利勃海尔，目录号：12084121）
Autoclave Autester ST（Selecta，目录号：4002517）
显微镜（尼康TMS显微镜，目录号：310450）
液氮罐（空气液体，目录号：ARPEGE40-L-102）
真空泵（Millipore，目录号：XF54 23050）
FACS Calibur流式细胞仪 TM [Becton Dickinson（BD）]
无限® M200酶标仪（Tecan，型号：Infinite ® M200）
封装工艺材料（除非指明其他公司，否则所有组件均为系统的一部分，并作为一个单元从Nisco封装单元Var V1购买，目录号：LIN-0203）（所有材料先前已对细胞微胶囊进行灭菌）：
1. 静电液滴发生器
2. 烧杯（直径80毫米，高40毫米，体积80毫升）
3. 搅拌
4. 针
5. 针座
6. 蠕动泵
7. 硅胶管
8. 不锈钢棒
9. 硅胶管
10. Luer 10 ml注射器（Braun，目录号：4606108V）

软件

Microsoft Office Excel（微软）
FlowJo ® V10（Flowjo，LLC）
SPSS statistics 22（IBM）
Eclipse Net软件，版本1.20.0（尼康）

程序

解冻和细胞培养条件
1. 需要时，通过在37°C水浴中快速解冻冷冻管直至没有观察到冰（4-5分钟），恢复D1间充质干细胞（D1MSC）和鼠成肌细胞（C2C12）。＆nbsp;
2. 接下来，将冷冻管置于层流罩中，将每个细胞悬浮液转移到50ml锥形离心管中，并用10ml完全培养基稀释样品。
3. 旋转细胞悬浮液，除去上清液，用20ml培养基重悬每个细胞沉淀。
4. 然后，将每个细胞悬浮液分别置于T-175烧瓶中，并在37℃，湿润的5％CO 2 / 95％空气气氛中孵育。
5. 根据将用于包封的细胞密度以及将要制造的批次的最终体积，根据需要在尽可能多的T-175培养瓶中培养细胞。当细胞融合率约为70％时，细胞应传代（如果1×10 6 细胞接种于T-175培养瓶中，则每2-3天传代一次）。
用于微胶囊化的海藻酸盐中不同细胞悬浮液的制备
1. 从T-175烧瓶中取出培养基，加入5 ml PBS，再次取出，取出培养基残留物。＆nbsp;
2. 加入5毫升0.25％胰蛋白酶，将烧瓶保持在37℃的培养箱中2-5分钟，然后轻轻敲打烧瓶侧面以去除细胞。＆nbsp;
3. 从细胞培养瓶中取出细胞悬浮液，转移到50ml锥形瓶中。
4. 通过40μm过滤器过滤细胞悬浮液以去除细胞聚集并用自动细胞计数器或者用Neubauer Chamber计数细胞。
5. 收集细胞悬浮液的体积以获得细胞包封所需的最终细胞量。
6. 旋转收集的细胞悬浮液（100 x g 5分钟）并小心弃去上清液。
7. 通过小心地添加所需体积的1.5％藻酸盐LVG溶液（参见配方）重悬细胞，以获得每ml藻酸盐密度5×10 6个细胞（对于4ml批次，2×10 需要7个细胞。）＆nbsp;
8. 使用无菌刮刀轻柔地旋转细胞悬浮液以使其均匀化。
注意：每种细胞类型都在此协议中单独进行微囊化。
细胞微囊化
1. 将藻酸盐细胞悬浮液转移到10ml无菌注射器中，避免形成气泡。将注射器放入蠕动泵（图1A）（视频1）。
  视频1.静电液滴发生器组件
注意：所有的微胶囊化程序都在生物安全柜中进行。
1. 将注射器连接到不锈钢针尖（内径0.17 mm），硅胶管为40 cm（图1B）。
2. 将含有小磁力搅拌器的无菌烧杯（80毫米直径，40毫米高度和80毫升体积）装入80毫升无菌氯化钙胶凝溶液中，并将其放在针头下（参见食谱）。＆nbsp;
3. 将磁力搅拌设定为200rpm（这将在胶凝过程中保持微胶囊分离）。
4. 对于380微米直径的微胶囊，将针座置于7厘米高（图1C），并确保针尖与氯化钙溶液之间的距离为2厘米。
  
  图1.细胞微囊化详细信息。 A.蠕动泵设定为5.9 ml / h。 B.完成Nisco ®微胶囊发生器的设置。 C.针头及其固定器的设置细节。
5. 将不锈钢棒放在胶凝浴内，并连接微胶囊发生器的电极。
6. 对于380±10μm直径的藻酸盐微胶囊，在蠕动泵（5.9ml / h）中设定电压（7kV）和流速的条件。
  注意：在所描述的条件下，我们获得380±10μm直径的藻酸盐微胶囊，其在涂布后将直径略微增加。随着针头直径的减小和电压的增加，珠子直径会减小。
7. 关闭电气安全笼（否则系统将无法工作）。＆nbsp;
8. 手动按下注射器，直到藻酸盐悬浮液到达喷嘴尖端（从硅胶管中取出空气）并以5.9毫升/小时的速度启动蠕动泵。＆nbsp;
9. 将藻酸盐溶液通过喷嘴推入烧杯中。
10. 当注射器是空的时，停止泵的流动并让藻酸盐微胶囊在氯化钙溶液中以200rpm的磁力搅拌混合至少10分钟以完全凝胶化。通过100μm过滤器过滤溶液，从氯化钙溶液中收集微胶囊。
11. 将100μm过滤器倒置并将其放在锥形管的顶部。
12. 接下来，收集微胶囊，将10毫升完全培养液加入过滤器底部，倒置。＆nbsp;
13. 用移液管将微胶囊转移到T-75烧瓶中，再加入10ml完全培养基。
14. 为了确认微胶囊的完整性，形状和均匀性，在倒置显微镜下通过相差来观察它们。将烧瓶置于37℃，湿润的5％CO 2 / 95％空气气氛的培养箱中进行进一步研究（图2）。
  注意：这些微囊化细胞类型可在培养基中维持至少2个月。
  
  图2.（A）藻酸盐微胶囊中的C2C12和（B）D1MSC细胞。比例尺：200μm。
冷冻保存过程的准备和条件
1. 将不同的CPA溶液预冷至4°C（参见食谱）。＆nbsp;
2. 将CoolCell ®容器预冷至4°C，在冰箱中保存30分钟以上。＆nbsp;
3. 标记2 ml冷冻管，置于4°C冰上。
冷冻保存过程
1. 从T-75烧瓶中收集微胶囊并将其置于1.5ml Eppendorf管中。让它们通过重力沉淀，并重复该过程直至获得200μl微胶囊。接下来，用移液管移除培养基（图3）。
  
  图3.重力沉积微胶囊
2. 在Eppendorf管中加入1 ml预冷的CPA溶液（参见食谱）。
  注意：CPA溶液可以新鲜制备，也可以在4°C下最多储存1周。
3. 将微胶囊悬浮液转移至2 ml冷冻管中，并将其保持在冰上20分钟（图4）。
  
  图4.低温保存前冷却样品
4. 将冷冻管转移至冷却的Coolcell ®容器中。
5. 将容器放入-80°C冰箱中，对样品进行缓慢控制冷却，并将其保持过夜。
6. 第二天，从-80°C冰箱中取出Coolcell ®容器，将冷冻瓶转移到液氮罐中进行长期储存。
微囊化细胞恢复
1. 小心地从液氮罐中取出冷冻瓶。尽快将它们转移到37°C水浴中快速解冻。
2. 将它们轻轻地在水浴中移动（3-5分钟），试图避免水与冷冻盒盖接触，以避免污染风险。在这方面，从尖端握住冷冻管或将其放置在聚酯支架上，避免尖端与水接触。
3. 将微胶囊从冷冻管转移到15ml锥形管中，并在室温下将10ml培养基稀释至15ml管中逐滴稀释。让微胶囊通过重力沉淀，然后除去培养基。重复此过程至少两次。
4. 在37℃下加入培养基，并将微胶囊在T-75烧瓶中于37℃在潮湿的5％CO 2 / 95％空气气氛中温育。
荧光显微镜下包囊细胞的活力评估
1. 从T-75烧瓶中收集20μl微胶囊，并将其置于1.5ml Eppendorf管中。让沉淀物通过重力去除介质。＆nbsp;
2. 将微胶囊冲洗三次（让微胶囊通过重力沉降）各自用1ml含有Ca 2+ +上的DPBS和Mg 2 + 。
3. 用300μl钙黄绿素/乙锭染色溶液稀释漂洗的微胶囊用于显微镜检查（参见食谱）。
4. 将含有微胶囊的染色溶液分配到96孔板的3个孔中（约100μl溶液/孔）。
5. 在室温下孵育45分钟，避光。＆nbsp;
6. 在荧光显微镜下评估包封细胞的活力（图5）。钙黄绿素（激发495nm，活细胞发射515nm）和乙锭（激发495nm，发射635nm）。可以分别观察这些染料的荧光;钙黄绿素与标准荧光素带通滤光片和乙锭与过滤器的碘化丙锭或德克萨斯红®染料。
  
  图5.解冻后培养7天时钙黄绿素/乙锭染色的冷冻保存的微囊化细胞的显微照片。比例尺：200μm。
微囊化细胞代谢活性的测定
1. 从T-75烧瓶中收集50μl微胶囊，将其放入1.5 ml Eppendorf管中，让其在重力作用下沉淀，然后取出培养基。＆nbsp;
2. 将包封的细胞重悬于700μl完全培养基中。
3. 将含有微胶囊的该溶液分配到96孔板的7个孔中（100μl溶液/孔）。另外，将100μl刚刚完全培养基分配到2个孔中（阴性对照）。
4. 向每个孔中加入10μl用于活力定量的溶液（CCK-8）。
5. 将96孔板在培养箱中的湿室内孵育4小时，温度为37℃。
6. 4小时后，将上清液转移到另一个96孔板中。
7. 使用Infinite ® M200酶标仪或另一种酶标仪（图6），在650 nm处测量吸光度，参比波长为650 nm。
  
  图6.解冻后第1天和第7天冷冻保存的微囊化（A）C2C12和（B）D1MSC细胞的代谢活性
流式细胞术对微囊化细胞的活力定量分析
1. 从T-75烧瓶中收集100μl相当于5×10 5个细胞的微胶囊，并将其置于1.5ml Eppendorf管中，让其在重力作用下沉淀，在培养基旁边除去。
2. 用DPBS冲洗两次微胶囊。
3. 除去上清液，加入100μl1％柠檬酸钠（参见食谱）。上下移液直至微胶囊溶解。
4. 将样品通过40μm细胞过滤器过滤到不同的15 ml锥形管中。＆nbsp;
5. 将管在100μL离心管中离心10分钟，弃去上清液以除去藻酸盐的残留物。＆nbsp;
6. 加入染色溶液（每个样品1毫升），孵育20分钟避光（见食谱）。细胞计数器校准需要对照样品（一种不含染料，另一种含有钙黄绿素，另一种含有乙锭）。＆nbsp;
7. 将样品转移至5 ml圆底管，以在FACS Calibur流式细胞仪 TM 中定量细胞活力（图7）。
  
  图7.解冻后第1天和第7天冷冻保存的微囊化（A）C2C12和（B）D1MSC细胞中死细胞的定量。值代表平均值±SD。 **： P ˂0.01和***： P ˂0.001与HA 5％相比。

数据分析

所有定量均一式三份进行，至少进行三次独立实验。平均值和标准差分别由Microsoft Office Excel中的函数“AVERAGE”和“STDEV”计算，统计分析使用SPSS软件进行。使用FlowJo ® V10（Flowjo，LLC）进行细胞分析仪数据分析。使用Eclipse Net软件版本1.20.0分析显微镜显微照片。
＆NBSP;在每个冷冻保存的微囊化细胞类型中，从第1天至第7天预期的代谢活性值增加，与由于微囊内的细胞增殖而使用的CPA无关（图6）。此外，在每个冷冻保存的微囊化细胞类型中死细胞百分比从第1天到第7天增加，与所使用的CPA无关（图7）。死细胞百分比的增加可以用冷冻保存诱导的起始细胞死亡现象来解释，因为在解冻24小时后细胞死亡值增加。

食谱

D1MSC完整媒体
从500ml DMEM（ATCC）瓶中取出10％体积并加入1％体积的抗生素/抗真菌溶液，并加入10％体积的FBS
C2C12完全中等
从500ml DMEM（Gibco）瓶中取出10％体积并加入1％体积的抗生素/抗真菌溶液和10％体积的FBS
DMSO 10％CPA溶液
在9ml每种完全细胞培养基中加入1ml DMSO，并将其储存在4℃
LMW-HA 5％CPA溶液（20 ml）
1. 将200mg LMW-HA粉末重悬于10ml完全培养基中并搅拌直至在无菌条件下溶解
2. 溶解后，加入10毫升完全培养基，并保存在4°C
1％甘露醇
1. 将1克甘露醇溶于100毫升蒸馏水中或按比例放大至所需体积
2. 搅拌直至甘露醇溶解并通过Millipore0.22μm过滤器过滤Stericup ®
55 mM氯化钙（500 ml）
1. 将2.44g氯化钙（96％纯度）溶解在500ml 1％甘露醇溶液中
2. 将氯化钙的量增加到更高的体积
3. 搅拌直至溶解，并通过Millipore0.22μm过滤器Stericup ®过滤
1％柠檬酸钠
1. 将1克柠檬酸钠溶于100毫升1％甘露醇中或按比例放大至所需体积
2. 搅拌直至其溶解并通过Millipore0.22μm过滤器Stericup ®过滤
1.5％藻酸盐LVG（NovaMatrix）
1. 将1.5g藻酸盐溶解于100ml 1％甘露醇中并搅拌
2. 当藻酸盐溶液透明时，通过0.20μm注射器过滤器过滤
注意：对于更高体积的藻酸盐溶液，请根据需要进行放大。较低或较高的藻酸盐浓度将要求您修改溶解在1％甘露醇中的藻酸盐的重量。我们建议过滤2毫升的步骤，因为较高的藻酸盐体积需要强度才能过滤，因为它的粘度很高。
钙黄绿素/乙锭染色液（用于显微镜检查）
将用于哺乳动物细胞的LIVE / DEAD ®活力/细胞毒性试剂盒（Life-Technologies）中提供的5μl乙锭和5μl钙黄绿素稀释到10 ml含有Ca 2 +的DPBS中和Mg 2 +
钙黄绿素/乙锭染色液（用于流式细胞仪）
1. 制备100μM溶液的钙黄绿素储备液，稀释用于哺乳动物细胞（Life-Technologies）的LIVE / DEAD ®生存力/细胞毒性试剂盒中提供的4μl钙黄绿素，156μlDMSO＆nbsp;
2. 对于仅使用钙黄绿素的对照，在1ml细胞培养基中加入2μl钙黄绿素原液＆nbsp;
3. 对于仅含有乙锭的对照，在LIVE / DEAD ®活力/细胞毒性试剂盒中加入1μl细胞培养基中提供的4μl乙锭＆nbsp;
4. 对于每个样品，加入2μl钙黄绿素原液，并在1ml细胞培养基中加入4μl乙锭
注意：使用不含血清和抗生素/抗真菌剂的每种细胞类型的细胞培养基。

致谢

该协议改编自先前发表的研究（Murua et al。，2009）和（Gurruchaga et al。，2015a）作者感谢巴斯克大学（UPV） / EHU）理所当然的团契。作者还要感谢ICTS“NANBIOSIS”的知识和技术援助，更具体地说是感谢UPV / EHU的CIBER-BBN的药物制剂单元（U10）。

利益争夺

作者与任何与该手稿中讨论的主题或材料有财务利益或财务冲突的组织或实体没有相关的从属关系或财务参与。这包括就业，咨询，酬金，股票所有权或期权，专家证词，已获得或正在申请的赠款或专利，或特许权使用费。

参考

Gryshkov，O.，Hofmann，N.，Lauterboeck，L.，Pogozhykh，D.，Mueller，T。和Glasmacher，B。（2015）。藻酸盐3D环境中来自普通mar猴 Callithrix jacchus 的多能基质细胞：冷冻保存程序的效果。低温生物学 71（1）：103-111。
Gurruchaga，H.，Ciriza，J.，Saenz Del Burgo，L.，Rodriguez-Madoz，J.R.，Santos，E.，Prosper，F.，Hernandez，R.M.，Orive，G。和Pedraz，J.L。（2015a）。冷冻保存微胶囊化的鼠间充质干细胞，通过基因工程分泌促红细胞生成素。 Int J Pharm 485（1-2）：15-24。
Gurruchaga，H.，Saenz del Burgo，L.，Ciriza，J.，Orive，G.，Hernandez，R。M. and Pedraz，J.L。（2015b）。细胞包封技术及其在药物输送中的应用进展。 Expert Opin Drug Deliv 12（8）：1251-1267。
Hutson，E.L.，Coleman，C.M.，Freestone，S.F.，Huckle，J.，Murphy，M。和Barry，F。（2009）。透明质酸作为间充质干细胞的冷冻保存剂。第55届骨科研究年会社会＆NBSP;
Iwama，A.，Yamada，C.，Uchida，K。和Ujihira，M。（2014）。与透明质酸预孵育可减少细胞密集培养细胞单层中冷冻保存后的细胞损伤。 em> Biomed Mater Eng 24（2）：1497-1506。
Mantri，S.，Kanungo，S。和Mohapatra，P。C.（2015）。使用极少使用DMSO的二糖对脐带血干细胞的低温保护作用。 Indian J Hematol Blood Transfus 31（2）：206-212。
Massie，I.，Selden，C.，Morris，J.，Hodgson，H。和Fuller，B。（2011）。使用无冷冻剂冷却器对包裹的肝球体进行低温保存：使用多步骤冷却进行高功能恢复个人资料。 Cryo Letters 32（2）：158-165。
Murua，A.，Orive，G.，Hernandez，R。M.和Pedraz，J.L。（2009）。基于冷冻方案的冷冻保存，用于长期储存微囊化成肌细胞。生物材料 30（20）：3495-3501。
Orive，G.，Santos，E.，Pedraz，J。L.和Hernandez，R。M.（2014）。应用细胞包封控制生物治疗药物的递送。 Adv Drug Deliv Rev 67-68：3-14。
Ruiz-Delgado GJ，Mancías-Guerra C，Tamez-GómezEL，Rodríguez-Romo LN，López-Otero A，Hernández-Arizpe A，Gómez-Almaguer D，Ruiz-ArgüellesGJ。（2009年）。脐带血干细胞移植中二甲基亚砜诱导的毒性：三例报告及文献复习。 Acta Haematol 122（1）：1-5。
Shu，Z.，Heimfeld，S。和Gao，D。（2014）。使用低温保存移植物的造血SCT：移植后的不良反应和输注前的冷冻保护剂去除。骨髓移植 49（4）：469-476。＆nbsp;
Ujihira，M.，Iwama，A.，Aoki，M.，Aoki，K.，Omaki，S.，Goto，E。和Mabuchi，K。（2010）。低分子量透明质酸对人皮肤成纤维细胞单层的低温保护作用。 Cryo Letters 31（2）：101-111。