材料和试剂

手术刀片＃10和＃11
Parafilm（Bemis，目录号：PM-99）
纸巾
10μl和1,000μl微量移液器吸头
100 x 15 mm I板（VWR，目录号：25384-310）
100 x 100 mm方板（VWR，目录号：10799-140）
100 x 15 mm（VWR，目录号：25384-302）和60 x 15 mm（VWR，目录号：25384-092）培养皿
1.7毫升微量离心管（VWR，目录号：87003-294）
25毫升血清移液管（VWR，目录号：89130-900）＆nbsp;
带0.2μM纤维素膜的过滤装置（Nalgene，目录号：121-0020）
1.5ml样品瓶（Shimadzu，目录号：221-34274-91），带隔膜的白色盖子
诉dahliae 菌株PD322和PD413（在20％甘油中分生孢子悬浮液并储存在-80°C）
甲。拟南芥生态型Col-0种子（Lehle Seed Co.）＆nbsp;
无菌MilliQ水
Murashige和Skoog（MS）基础培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M0404-10L）
蔗糖（Alfa Aesar，目录号：A15583）
颗粒状琼脂（Difco，目录号：214530）
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（Difco，目录号：213400）
200标准乙醇（KOPTEC，目录号：64-17-5）
6％次氯酸钠（CLOROX）＆nbsp;
正己烷（EMSURE，目录号：1043744000）
C 7 -C 30 饱和烷烃（Sigma-Aldrich，目录号：49451-U）＆nbsp;
99.99％纯氦气＆nbsp;
0.5x PDA介质（参见食谱）
MS琼脂培养基（见食谱）

设备

耐热玻璃瓶
10μl和1,000μl微量移液管
解剖刀
钳子
软木钻孔机（直径5毫米）
SPME纤维支架（Supelco，目录号：57330-U）
15毫升透明玻璃小瓶（Supelco，目录号：27159），带PTFE /硅胶隔垫的螺帽＆nbsp;
SPME纤维组件，带50 /30μmDVB/ CAR / PDMS纤维涂层（Supelco，目录号：57328-U）
电动移液器控制器（Drummond Scientific Co.，目录号：4-000-110-TC）
Vortex（VWR，型号：Genie 2）
台式离心机（Eppendorf，型号：5417C）＆nbsp;
台式振动台（VWR，目录号：57018-754）
分析天平（Mettler Toledo，型号：AE-100）
解剖显微镜（Zeiss，型号：Stemi 2000-C）
孵化器（Sheldon Manufacturing，型号：1510E）
植物生长室（Conviron，型号：CMP5090）
柔性臂电极座（Mettler Toledo，目录号：30266628）
GC-MS系统（Shimadzu，型号：GCMS-QP2010 ultra）配备AOC-20i自动注射器（Shimadzu，目录号：221-72315-48）＆nbsp;
Rtx-Wax毛细管（60 m，0.25 mm ID和0.25μmdf）色谱柱（Restek，目录号：12426）
4°C冰箱
高压灭菌器

软件

ImageJ（版本1.52a）＆nbsp;
GC-MS解决方案（Shimadzu，版本2.72），一个支持GC-MS实时和运行后分析的软件包
美国国家标准与技术研究院（NIST）质谱库（Shimadzu，版本11）

程序

我用平板测定法（图1）
1. 使用无菌的10μl移液管尖端划线 V. dahliae 在0.5x PDA（配方1）板上以Z字形图案储存，并在22°C下孵育10天。＆nbsp;
2. 表面消毒 A.拟南芥种子如下：
  1. 将1ml 95％乙醇加入含有种子的1.7ml微量离心管中，涡旋并孵育1分钟。
  2. 除去乙醇后，用无菌MilliQ水洗涤一次并弃去水。
  3. 加入1ml 6％次氯酸钠溶液，涡旋，并以100rpm振荡孵育15分钟。
  4. 在除去次氯酸钠溶液后，用无菌MilliQ水洗涤两次。
  5. 将种子在1 ml无菌MilliQ水中于4°C在黑暗中孵育3天。＆nbsp;
3. 用MS琼脂（配方2）准备方形板，并使用带刀片＃10的无菌手术刀将介质切成10 x 10 mm的碎片。
4. 使用抽吸将一粒种子保持在10μl微量移液管的尖端，然后将种子释放到每个琼脂片上。用两层Parafilm密封平板并置于设置在22℃，12小时光照的植物生长室中（4,500勒克斯，60μmol光子m -2 s -1 ）和60％相对湿度7天。
5. 通过将8ml MS琼脂加入一个隔室并将8ml 0.5x PDA加入另一个隔室来制备I盘。＆nbsp;
6. 转移五个 A.将thaliana 幼苗（大小和生长阶段相似）连同附着的琼脂片一起使用带有刀片＃10的无菌解剖刀到I板的MS侧。
7. 使用加热灭菌的软木蛀虫沿 V的活跃生长边缘生成培养塞。 dahliae 培养并使用带刀片＃11的无菌手术刀将一个塞子（倒置）放到I板的PDA侧的远端。
8. 用两层Parafilm密封接种的I板，并在每个实验中将其放置在植物生长室中指定的时间量（具体实施例参见Li 等人，2018b）。
图1.基于I板的分析的工作流程
提取由 V产生的VC。 dahliae （图2）
1. 接种 V的插头。在8ml PDA上的大丽花培养物在15ml透明玻璃小瓶中倾斜。用Parafilm密封小瓶。＆nbsp;
2. 在22°C孵育直至培养物完全覆盖PDA倾斜表面，通常需要8天。
3. 用含有PTFE /硅胶隔垫的螺帽更换Parafilm并孵育一天。
4. 通过将SPME针放入设定在230°C的GC进样口1小时，在VC萃取前调节SPME纤维。
5. 将经过调节的SPME光纤插入进样口并启动表1中所示的GC温度程序。在进样口中将光纤解吸5分钟。 5分钟后收回光纤并取出针头，并在程序完成后检查生成的色谱图。背景峰的强度（=空白样本）应该非常低。否则，重复解吸纤维。＆nbsp;
6. 将SPME纤维留在取样瓶的顶部空间中，提取VC 1小时。使用柔性臂电极夹固定SPME光纤夹持器的位置，使所有提取的光纤插入深度均匀。＆nbsp;
图2.挥发性化合物提取的工作流程

表1.气相色谱 - 质谱分析的条件
提取的VC的GC-MS分析（图3）
1. 按照表1中所述的条件，使用GC-MS系统（手动进样模式，图3A）分析提取的VC。在将SPME针从每个取样瓶中收回后立即将其插入GC进样口。 Desorb VC与SPME纤维结合5分钟。使用Rtx-Wax毛细管色谱柱，因为它表现出更好的保留和分离极性VC。＆nbsp;
2. 将光纤放入GC进样口20分钟进行解吸，然后再提取另一个VC样品。
3. 使用自动样品注射模式分析C 7 -C 30 饱和烷烃标准品（图3B）。将AOC-20i自动注射器连接到GC进样口。将1.5ml含有0.5ml标准溶液（用正己烷1:50稀释）的样品瓶放在自动注射器的支架上。将1μl溶液注入GC-MS系统，并使用相同的色谱柱和条件进行分析（表1）。
图3.气相色谱 - 质谱分析 A.从 V中提取的挥发性化合物（VC）。 dahliae 通过手动注射模式进行分析。 B.使用自动进样模式分析Alkane标准品。

数据分析

个体VC处理后根系生长和发育的评估
1. 共培养后，用镊子轻轻拉动 A. thaliana 幼苗来自培养基而不损伤其根。
2. 用纸巾去除根部多余的水分。
3. 使用镊子从枝条上分离根部，使用分析天平立即称量根部。＆nbsp;
4. 将根部安装在平坦的表面上（例如，100 x 15 mm培养皿）并在其上加3 ml水。＆nbsp;
5. 使用镊子轻轻地展开根部，使主根和侧根不重叠。
6. 使用60 x 15 mm培养皿的底部使根部变平（图4A），以便进行后续测量：＆nbsp;
  1. 在解剖显微镜下计算侧根的数量，包括所有分支。＆nbsp;
  2. 拍摄根部照片并将它们导入ImageJ。按照ImageJ中的说明测量主根长度（图4B）。
7. 通过将侧根数除以主根长度来计算每个样本的侧根密度。
  
  图4. A的分析。用 V产生的挥发性化合物处理后的拟南芥根。 dahliae 。 A.扁平 A。通过用60×15mm培养皿压制来制备拟南芥。 B.用于在VC处理后测量主根长度（由黄线表示）的ImageJ数据的快照。使用红色箭头指示主根的开始和结束。
鉴定个别化合物
1. 使用GC-MS Solution包中的运行后分析软件进行峰发现，峰积分和保留时间校正。
2. 使用以下方法测定每种化合物（峰）的推定特性。
  1. 将得到的质谱图与NIST质谱库（版本11）中存档的参考数据进行比较。匹配因子≥90％的最高命中率被列入暂定标识化合物的“肯定列表”。
  2. 使用以下等式计算每种化合物的保留指数（RI）（用于程序升温色谱法）（Kováts，1958）。
    
    哪里，
    x =样品中未知化合物
    n =未知化合物前的烷烃中的碳数
    N =未知化合物后烷烃中的碳数
    Tx =未知化合物的保留时间
    Tn =前一烷烃的保留时间
    TN =以下烷烃的保留时间
  将实验获得的每个峰的RI与NIST Chemistry WebBook中的RI进行比较（ href="https://webbook.nist.gov/" target="_blank"> https://webbook.nist.gov ，使用极柱）。为了确认同一性，使用了与公布值的±2％的最大相对偏差（Stoppacher et al。，2010）。

笔记

I平板测定可能不适合研究由快速生长的真菌产生的VC的影响，因为真菌菌丝体可能在I板的中央分隔物上生长并污染MS培养基。当我们研究生长速度比 V的真菌时，我们从I板分隔器的两侧去除琼脂条以防止这种污染。 dahliae （Bitas et al。，2015）。然而，对于像 Trichoderma 这样的真菌，这种方法还不够（Li et al。，2018a）。
由于I板的空间有限，在其早期生长阶段只有小型植物（例如， A.thaliana 和 Nicotiana benthamiana ）是合适的用于此测定。＆nbsp;
在使用的生长条件下，对 A的生长促进作用。早在与 V共培养7天后，拟南芥就变得显着了。 dahliae （Li et al。，2018b）。＆nbsp;
因为 A.在共培养14天后，拟南芥开始引发花序发育，我们建议共培养的持续时间不应超过14天。＆nbsp;
在这里，我们仅描述了如何分析VC暴露后的根系生长和发育。还可以分析VC暴露植物的其他性状，如枝条重量，叶绿素含量，生理和分子变化（ eg ，Zhang et al。，2007和2008 ; Li et al。，2018b）。＆nbsp;
可能需要评估几种SPME纤维和GC色谱柱以优化VC提取和分析方案。在我们的研究中，DVB / CAR / PDMS 50 /30μm纤维涂层提取了最多的VC，Rtx-Wax毛细管柱比DB-5柱更好地分离了提取的VC。
从未接种的PDA倾斜中提取的VC的分析对于排除源自培养基和环境的VC是必要的。

食谱

0.5x PDA中等（1升）
19.5克PDA
将高压灭菌的培养基冷却至50°C后倒入＆nbsp;
MS琼脂培养基（1升）
4.5克MS和7.5克琼脂
将高压灭菌的培养基冷却至50°C后，加入5 ml 50％（w / v）蔗糖（过滤灭菌）
浇注前要好好混合

致谢

我们对真菌风险投资的研究得到了美国农业部 - 特种农作物多州计划（AM170200XXXXG006）的资助，以及来自Storkan-Hanes-McCaslin基金会的NL和NL的哈克学位论文研究奖。 I plate试验和VC提取方法分别采用Ryu 等人（2003）和Stoppacher 等人（2010）。