材料和试剂

血清素测量
1. Sep-Pak C18滤芯（沃特世，目录号：WAT020515）
2. 0.20μm过滤器（Millex-LG Millipore，目录号：SLLGH13NL）
3. 注射器（10毫升，阿拉丁，A2292-05）
4. 注射器（1毫升，阿拉丁，A2292-01）
5. 50毫升管
6. 2毫升离心管
7. 1.5毫升离心管
8. 水稻（ Oryza sativa L.）植物，在室内设施或田间种植
  注：在本实验中，野生型（WT）栽培品种贾哲B及其OsT5H（编码色胺5水解酶）突变体系贾哲LM（Lu 等。，2016）被使用。
9. 褐飞虱（BPH; Nilaparvata lugens Stål），在实验室饲养1个月大的TN1（易感水稻品种）植物（最初从田间采集）
10. 条纹螟虫（SSB， Chilo suppressalis Walker），在实验室饲养人工饲料
11. 液氮
12. 甲醇（阿拉丁，目录号：M117118）
13. 三氟乙酸（阿拉丁，目录号：T103297）
14. 高氯酸（阿拉丁，目录号：P112070）
15. 血清素标准品（西格玛，目录号：14927）
16. 醋酸铵
17. 甲酸
18. 氮
19. 氩
通过人工饲料喂养测定BPH存活率＆nbsp;
1. 玻璃圆筒（图2A-2B），自制，ø，4厘米;身高，8厘米;带48个小孔（ø，0.8 mm）
2. Parafilm M（Parafilm，PM996）
3. 1.5毫升管（离心管）
4. 滤纸（Sangon Biotech，目录号：F503316）
5. 塑料管（24 x 95 mm）
6. 甘氨酸（Sangon Biotech，目录号：A100167）
7. L-丙氨酸（Sangon Biotech，目录号：A600022）
8. L-精氨酸盐酸盐（Sangon Biotech，目录号：A600205）
9. L-天冬酰胺（Sangon Biotech，目录号：A694341）
10. L-天冬氨酸（Sangon Biotech，目录号：A600091）
11. L-半胱氨酸（Sangon Biotech，目录号：A600132）
12. γ-氨基丁酸（Sangon Biotech，目录号：A600040）
13. L-谷氨酸（Sangon Biotech，目录号：A600221）
14. L-谷氨酰胺（Sangon Biotech，目录号：A100374）
15. L-组氨酸（Sangon Biotech，目录号：A604351）
16. L-蛋氨酸（Sangon Biotech，目录号：A100801）
17. L-异亮氨酸（Sangon Biotech，目录号：A100803）
18. L-亮氨酸（Sangon Biotech，目录号：A100811）
19. L-Proline（Sangon Biotech，目录号：A600923）
20. L-赖氨酸盐酸盐（Sangon Biotech，目录号：A110437）
21. L-苯丙氨酸（Sangon Biotech，目录号：A600991）
22. L-丝氨酸（Sangon Biotech，目录号：A601479）
23. L-苏氨酸（Sangon Biotech，目录号：A610919）
24. L-色氨酸（Sangon Biotech，目录号：A601911）
25. L-酪氨酸（Sangon Biotech，目录号：A601932）
26. L-Valine（Sangon Biotech，目录号：A600172）
27. 生物素（Sangon Biotech，目录号：A100340）
28. 泛酸钙（Sangon Biotech，目录号：A600683）
29. 氯化胆碱（Sangon Biotech，目录号：A600299）
30. 叶酸（Sangon Biotech，目录号：A610466）
31. 肌醇（Sangon Biotech，目录号：A600536）
32. 烟酸（Sangon Biotech，目录号：A610660）
33. 盐酸吡哆醇（Sangon Biotech，目录号：A600797）
34. Ribo fl avin（Sangon Biotech，目录号：A600470）
35. 盐酸硫胺素（Sangon Biotech，目录号：A500986）
36. 抗坏血酸（Sangon Biotech，目录号：A100143）
37. CaCl 2 •2H 2 O（Sangon Biotech，目录号：A100556）
38. CuCl 2 •2H 2 O（Sangon Biotech，目录号：A603090）
39. FeCl 3 •6H 2 O（Sangon Biotech，目录号：A600201）
40. MnCl 2 •4H 2 O（Sangon Biotech，目录号：A500331）
41. ZnCl 2 （Sangon Biotech，目录号：A501003）
42. MgCl 2 •6H 2 O（Sangon Biotech，目录号：A100288）
43. KH 2 PO 4 （Sangon Biotech，目录号：A100781）
44. 蔗糖（Sangon Biotech，目录号：A100335）
45. BPH人工饲料（D-97）（见食谱）
通过人工饲料喂养测定SSB体重
1. 塑料桶
2. 新鲜野生稻（ Zizania aquatica ）茎（来自超市）（Han et al。，2012）
3. 大豆粉（来自超市，中国品牌）
4. 酵母精华粉（来自中国超市）
5. 酪蛋白（西格玛，目录号：C7078）
6. 蔗糖（国药化学试剂有限公司，目录号：A100335）
7. 抗坏血酸（Sangon Biotech，目录号：A100143）
8. 山梨酸（Sangon Biotech，目录号：SB0899）
9. 胆固醇（Sangon Biotech，目录号：C0433）
10. 氯化胆碱（AMRESCO，目录号：0448）
11. Wesson盐混合物（Sigma，目录号：W1374）
12. 40％甲醛（国药化学试剂有限公司，目录号：10010018）
13. 甲基对羟基苯甲酸酯
14. 琼脂（国药化学试剂有限公司，10000561）
15. 烟酸酰胺（Sangon Biotech，目录号：A510659）
16. 盐酸吡哆醇（Sangon Biotech，目录号：A600797）
17. Ribo fl avin（Sangon Biotech，目录号：A600470）
18. 盐酸硫胺素（Sangon Biotech，目录号：A500986）
19. Cyanocoblamine（Fluka，目录号：82897）
20. 叶酸（Sangon Biotech，目录号：A610466）
21. 泛酸钙（Sangon Biotech，目录号：A600683）
22. 生物素（Sangon Biotech，目录号：A100340）
23. SSB的半人工饲料配方（见食谱）

设备

冷藏摇床（华力达股份有限公司，型号：HZ-9210K）
离心机（Eppendorf，型号：5804R）
旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器有限公司，型号：RE52CS）
-20°C冰柜
高效液相色谱仪，Agilent 1200 infinity系列带二极管阵列检测器（DAD），用于植物血清素测定＆nbsp;
HPLC-MS系统，Agilent Technologies 1290与Agilent 6460三重质量选择检测器在多反应监测（MRM）工作模式下进行BPH血清素测定＆nbsp;
用于HPLC的C18柱（Agilent，TC-C18（2），4.6×250mm，5μm）
用于HPLC-MS的C18柱（Agilent，Zorbax XDB，2.1 x 150 mm，3.5μm）
分析天平，准确度为0.00001 g
-80°C冰箱
4°C冰箱
生长室
搅拌机
高压灭菌器
Crisper

软件

方差（ANOVA）程序StaView，用于统计分析

程序

量化植物中的血清素水平
根据Kang 等人（2007），通过HPLC对植物中5-羟色胺的水平进行定量，并进行一些修改。＆nbsp;
1. 使用研杵在液氮中研磨新鲜组织（叶/茎/根）并立即储存在-80℃冰箱中。
2. 重量为1至3克粉末，在轨道振荡器（4℃，200转/分钟）上摇动10分钟，溶解在8毫升甲醇中。＆nbsp;
3. 将混合溶液在13,500 x g 下在4℃下离心5分钟。＆nbsp;
4. 使用具有Millex-LG过滤器（0.2μm）的注射器将上清液转移并过滤至新管，在室温下加入2ml蒸馏水（总量的1/4体积）。
5. 将上述溶液缓慢注入预活化的Sep-pak C18柱中（首先用三倍体积的柱式柱中的甲醇洗涤，然后用相同量的蒸馏水洗涤）并将流出物收集到50ml管中。
6. 使用10 ml 80％甲醇清洗滤芯，将流出物收集到50 ml管中。＆nbsp;
7. 将流出物转移到圆底烧瓶中，在旋转蒸发器中干燥（40℃，真空下）。＆nbsp;
8. 向烧瓶中加入500μl50％甲醇，轻轻摇动溶解残留物。＆nbsp;
9. 分析反相HPLC上的血清素水平。将10μl样品溶液注入C18柱，与含有0.3％三氟乙酸的10％甲醇水的等度溶液混合，流速为0.8ml / min，并在280nm处检测信号。＆nbsp;
10. 制备浓度为2,1,0.5,0.2,0.1μg/ ml的标准5-羟色胺。如上所述分析10μl血清素标准溶液以确定保留时间和浓度与峰面积之间的定量关系。
11. 根据血清素保留时间点计算血清素浓度。
棕色飞虱（BPH）中血清素水平的定量（图1）
BPH体内血清素的含量低于植物，因此血清素的测量需要在HPLC-MS上进行，这里是Ma 等人修改的方案（2011）。
1. 将约15只成年昆虫从稻植物收集到2ml离心管中。饥饿12小时后，在液氮中冷冻，均化成粉末并储存在-80℃的冰箱中。
2. 将10-20mg昆虫匀浆转移至1.5ml离心管中，在短暂涡旋后加入300μl冰冷的0.1M高氯酸，并在冰上保持10分钟。
3. 将混合物在14,000 x g 下在4℃下离心10分钟。＆nbsp;
4. 使用具有Millex-LG过滤器（0.2μm）的注射器将上清液转移并过滤至新管，并储存在-20℃直至HPLC-MS分析。
5. 在多反应监测（MRM）工作模式下，分析HPLC-MS系统，Agilent Technologies 1290和Agilent 6460三重质量选择检测器的血清素水平。将10μl样品溶液注入C18柱（Zorbax XDB，2.1×150mm，3.5μm）。以0.3ml / min的流速与梯度洗脱混合。洗脱液由含有0.1％甲酸和甲醇的2 mmol / L乙酸铵组成，前2.5 min内甲醇比例从19％增加到90％（v / v），甲醇比例保持在90％，从2.5到4.5分钟
6. MS系统的设置为：气体温度：325°C，气体流量：5 L / min，鞘气温度：350°C，鞘气流量：11 L / min，喷雾器压力：344.8 kPa，毛细管电压：3,000 V ，喷嘴电压：正模式下为500 V.母离子（m / z）177，子离子（m / z）160。使用氮气作为干燥和鞘气，使用氩气作为碰撞气体。
7. 制备浓度为2,1.5ng / ml的标准5-羟色胺溶液。如上所述分析10μl血清素标准溶液。
  
  图1.水稻组织（D）和以WT或突变水稻品系为食的BPH雌性成虫中血清素测定（AC）和血清素含量的色谱图。 A.血清素的HPLC色谱图，标准品（绿色）（），WT（Jiazhe B，蓝线）及其 OsT5H 突变体。 B.WP（蓝线）和突变体（红线）中血清素的HPLC色谱图。红色箭头指向的峰意味着化合物5-羟色胺缺乏突变体。 C.在多反应监测（MRM）工作模式中使用HPLC-MS测量5-羟色胺。 D.饲喂WT（Jiazhe B）或突变体（Jiazhe LM）水稻植株后，WT家宰叶和茎中5-羟色胺含量的BPH雌性中的血清素含量。在测定之前，雌性成虫饥饿12小时。
BPH人工饮食实验
人工饲料实验如前所述进行（Fu et al。，2001; Ji et al。，2017）。＆nbsp;
1. 根据Koyama 等人（1988）制备BPH人工饲料（D-97），由Fu 等人修改（2001），补充血清素浓度为0.1和1μg/ ml。
2. 用封口膜覆盖玻璃圆筒的一端（图2A-2B），将40μl人工饲料（图2C）滴在中心的封口膜上，用另一层封口膜覆盖（图2D-2F）。
3. 插入一块湿滤纸（2 x 6 cm）并将20个二龄BPH若虫释放到圆筒中（图2G）。
4. 将另一端覆盖为步骤C2。用黑色棉布包裹圆筒（图2H）。
5. 将圆柱置于28℃的生长室中16小时/ 8小时昼/夜循环，光子通量密度为250μmol光子m -2 s -1 。
6. 每天，将若虫转移到一个新的圆筒（与上面相同的准备）与新鲜饮食，并同时记录死亡率五天。
  
  图2.为BPH人工饲料实验制备气瓶的逐步程序
SSB人工饲料实验
1. 根据Han et al。（2012）准备人工饲料，适当补充1μg/ g血清素。
2. 将人工饲料切成小块（图3A），并将一个插入每个塑料管（24 x 95 mm）。
3. 为了生产新生儿，将2-3个叶片段用SSB鸡蛋钉在一个昆虫针上，并放入管中，人工饲料不添加5-羟色胺（图3B）。＆nbsp;
4. 将一个新生儿转移到一个管中，其中一个人工饲料颗粒补充有1μg/ g血清素（图3C）。
5. 将管放置在生长室中，光子通量密度为250μM照片m -2 s -1 ，在8小时光照/ 16小时黑暗状态下，28° C。每两天更换一次饮食（图3D）
6. 每天检查幼虫发育阶段，并在每次蜕皮后称重幼虫，直至6 th 龄期。
  
  图3. SSB卵孵化和人工饲料实验的逐步程序
  
  为了支持5-羟色胺在水稻中BPH和SSB抗性中的作用，这种激素的有益作用在人工饲料中得到证实，BPH（图4A）和SSB（图4B）的性能均得到提高。
  
  图4.外源性5-羟色胺的加入吸引BPH和SSB喂养。 A.在人工饲料中加入5-羟色胺可提高BPH的存活率。相对存活率（％）=（Nt-Nc）/ Nc×100，Nc和Nt分别代表在给定时间点不含和含有5-羟色胺的人工饲料中存活的若虫的数量。 B.在人工饮食中添加5-羟色胺可增强SSB性能。控制代表没有血清素的人工饮食。每次处理使用100只SSB幼虫。

数据分析

在这些实验中使用单因素方差分析（ANOVA）程序StaView进行统计学分析。数据以平均值存在，标准误差为误差条。当Tukey检验中概率（ P ）小于0.05时，差异被认为是显着的。

笔记

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。

食谱

BPH人工饲料（D-97）
为制备100毫升饮食，加入（mg）：
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>甘氨酸
30
L-丙氨酸
130 L-精氨酸盐酸盐
175 L-天冬酰胺
230 L-天冬氨酸
100 L-半胱氨酸
80 L-胱氨酸盐酸盐
20 γ-氨基丁酸
10 L-谷氨酸
250 L-谷氨酰胺
240 L-组氨酸
80 L-蛋氨酸
70 L-异亮氨酸
100 L-亮氨酸
240 L-Proline
100 L-赖氨酸盐酸盐
200 L-苯丙氨酸
200 L-丝氨酸
400 L-苏氨酸
130 L-色氨酸
105 L-酪氨酸
10 L-Valine
300 生物素
0.05 泛酸钙
5 氯化胆碱
50.0 叶酸
0.5 肌醇
50.0 烟酸 15.0 盐酸吡哆醇
2.5 Ribo fl avin
0.5 盐酸硫胺素
2.5 抗坏血酸
100.0 CaCl 2 •2H 2 O
3.115 CuCl 2 •2H 2 O
0.268 FeCl 3 •6H 2 O
2.228 MnCl 2 •4H 2 O
0.793 ZnCl 2
0.396 MgCl 2 •6H 2 O
200 KH 2 PO 4
500 蔗糖
9,000
加入蒸馏水至总体积100毫升
将pH调节至6.8
半人工饲料配方SSB（5升）
1. 将1,000克新鲜的 Zizania aquatica 切成小块并在搅拌机中在2,300毫升水中均化
2. 将匀浆与300g大豆粉，200g酵母提取物粉末，100g酪蛋白和100g蔗糖在塑料桶（10L）中混合。在高压釜中将混合物在121℃下灭菌30分钟
3. 在2,500ml水中加热120g琼脂直至沸腾，将上述高压灭菌的混合物倒入琼脂溶液中
4. 准备200毫升维生素C 30克，山梨酸10克，胆固醇2克，氯化胆碱3克，威森盐混合物1克，对羟基苯甲酸甲酯10克和维生素复合物1包装（含烟酸酰胺0.05216克;维生素B1： 0.01312克;维生素B2：0.02624克;维生素B6：0.01312克;维生素B12：0.00032克;叶酸：0.01312克;泛酸钙：0.05216克;生物素：0.00128克）
5. 将200 ml溶液倒入 Zizania aquatica 混合物中，冷却至60°C，并加入6 ml 40％甲醛
6. 混合均匀后，将混合物放入保鲜盒中并在4℃下储存

致谢

本研究得到了中国国家重点研究发展计划（2016YFD0102103），浙江省标准化研究所的资助。农业（粮食）作物育种项目（2016C02050-2），中国博士后科研项目（2017M620248）。

利益争夺

没有任何利益冲突或竞争利益。

参考

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Han，L.，Li，S.，Liu P.，Peng Y.和Hou，M。（2012）。新的人工饲料，用于连续饲养 Chilo抑制症（鳞翅目：Crambidae）。 Ann Entomol Soc America 105（2）：253-258。
Ji，R.，Ye，W.，Chen，H.，Zeng，J.，Li，H.，Yu，H.，Li，J。和Lou，Y。（2017）。唾液内切-β-1,4-葡聚糖酶作为效应器，使褐飞虱能够以水稻为食。植物生理学 173（3）：1920-1932。
Kang，S.，Kang，K.，Lee，K。和Back，K。（2007）。水稻植物中色胺5-羟化酶和血清素合成的表征。植物Cell Rep 26（11）：2009-2015。
Koyama，K。（1988）。飞虱和叶蝉的人工饲养和营养生理学（Homoptera：Delphacidae and白头鲈（Deltocephalidae）on holidic diet。 JARQ 22（1）：20-27。
Lu，H.P.，Luo，T.，Fu，H.W.，Wang，L.，Tan，Y.Y.，Huang，J.Z.，Wang，Q.，Ye，G.Y.，Gatehouse，A.M.R.，Lou，Y.G。和Shu，Q.Y。（2018）。通过抑制血清素生物合成介导的水稻对害虫的抗性。 Nat植物 4（6）：338-344。
Lu，H.P.，Zhang，H.L.，Fu，H.W.，Li，Y.F。和Shu，Q.Y。（2016）。水稻新型病变模拟突变体的鉴定和鉴定。核农业科学期刊 30：1037-1044。（用中文（表达）
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