材料和试剂

不含RNase的塑料移液器吸头（10μl，20μl，200μl，1,000μl）
1.7毫升无RNase的微管
0.2毫升无RNase PCR管
使用Direct-Zol RNA MiniPrep Plus（Zymo Research，目录号：R2072）的miRVana miRNA分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM1560）或TRIzol试剂（Ambion，目录号：15596026）
RiboLock RNase Inhibitor（赛默飞世尔科技，目录号：EO0381）
T4 RNA连接酶1（ssRNA连接酶）（NEB，目录号：M0204S）
T4 RNA连接酶2，截短的（NEB，目录号：M0242S）
RppH酶（NEB，目录号M0356S）
QScript Flex cDNA合成试剂盒（Quanta，目录号：95049-025）
Phusion高保真DNA聚合酶（NEB，目录号：M0530S）
Agencourt Ampure XP（Beckman Coulter，目录号：A63881）或SPRI精选试剂盒（Beckman Coulter，目录号：B23319）
RNA BR检测试剂盒（Quibit，目录号：Q10210）
dsDNA HS assay试剂盒（Quibit，目录号：Q10210）
PEG 8000（NEB，目录号：B1004）
无核酸酶水（Sigma-Aldrich，目录号：W4502）
乙醇绝对＆nbsp;
异丙醇（异丙醇）化学等级＆nbsp;
溴化乙锭（hylabs，目录号：BP451）
凝胶加载染料紫色（6x）（NEB，目录号：B7024）
[可选]低范围超琼脂糖（Bio-Rad，目录号：161-3107）
ATP（NEB，目录号：P0756S）
DMSO（NEB，目录号B0515）
Tris（Spectrum，目录号：s1519）
硼酸（Bio-Lab，目录号：000201059100）
EDTA（J.T. Baker，目录号：8993-01）
50 bp DNA ladder（NEB，目录号：N3236s）
寡核苷酸：所有寡核苷酸均来自IDT（ www.idtdna.com ）

[可选] NucleoSpin凝胶和PCR Clean-up试剂盒（Macherey-Nagel，目录号：740609.50）或Gel / PCR DNA片段Extraction kit（Geneaid，目录号：DF004）
5x TBE（见食谱）

设备

微型移液器（Gilson，Pipetman）
DynaMag-2磁力架（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
台式微量离心机，非冷藏（5424，带Rotor FA-45-24-11，Eppendorf，目录号：5424000010）
涡旋混合器，平头，Vortex-Genie 2（科学工业，型号：SI-0266）
用于1.7 ml管的冷却块（MS，目录号：MC-0203）
琼脂糖凝胶电泳仪
电泳电源＆nbsp;
凝胶成像仪（Bio-Rad，Gel Doc XR +）
荧光计，Quibit 2.0（Invitrogen，型号：Q32866）
热循环仪（Biometra，TProfessional）
Tapestation / Bioanalyzer

程序

协议大纲

RNA样品的制备
1. 使用基于柱的RNA提取试剂盒准备RNA样品
  注意：
  1. RNA来源：使用该协议，我们成功地从 C中制备了文库。线虫 s，果蝇，人类，拟南芥和真菌RNA。因此，我们假设它也适用于其他物种。
  2. 基于柱的试剂盒可实现小RNA的无偏差恢复。不要使用基于异丙醇沉淀RNA的方案，因为它们导致小RNA的回收率差。在我们的手中，使用 MiRVana miRNA分离试剂盒（ Ambion ）或 Direct-Zol RNA miniprep （ Zymo ）产生了优秀的图书馆。＆nbsp;
  3. 某些试剂盒，例如MiRVana试剂盒（Ambion），可以提取总RNA或分离的高分子量（HMW）和低分子量（LMW）级分。使用LMW作为起始材料可以获得更清晰的库。
2. 测量样品浓度
  注意：我们使用Qubit荧光计，但也可以使用NanoDrop。
3. 通过电泳或更好的Bioanalyzer / TapeStation评估RNA质量
  注意：为避免较长RNA类型的降解产物污染文库，请仅使用高质量的RNA（如果使用凝胶电泳或RNA完整性数字[RIN]评估，则使用尖锐的非降解rRNA条带表示> 8.5如果使用生物分析仪/ TapeStation）。
结扎3'适配器
注意：sRNA与5'-腺苷酸化3'-衔接子之间的连接反应由T4 RNA连接酶2催化，在没有游离ATP的情况下被截短。＆nbsp;
1. 在不含RNase的1.7 ml微量管中混合
2. 通过上下移液6-8次或轻轻涡旋混合均匀。＆nbsp;
3. 在72°C孵育3分钟。
4. 直接转移到冰上2分钟。＆nbsp;
5. 简要地旋转下来。
  注意：
  1. 如果您不受RNA量的限制，可以从5μg总RNA或0.5μgLMWRNA开始，但也可以以1/10甚至1/100的量开始;我们成功地从2 ng纯化的合成22 nt寡核苷酸库中制备了一个文库。对于 C.线虫 100μl蠕虫/卵子颗粒产生~200μg总RNA。＆nbsp;
  2. 适配器过量会促进适配体二聚体的产生。 0.5μl的100μM3'-衔接子可用于5μg总RNA或0.5μgLMWRNA。对于较低的起始量，相应地稀释3'-适配器和5'-适配器。＆nbsp;
  3. 重要的是在变性步骤后立即将样品转移到冰中以防止二级结构重新形成。
6. 添加到样本
7. 通过上下移液6-8次或轻轻涡旋混合均匀。＆nbsp;
8. 在25°C孵育1小时。
  注意：
  1. T4 Ligase 2截短后，50％PEG在一个单独的管中到达。＆nbsp;
  2. 首先添加RNase抑制剂以防止RNA降解。
去磷酸化（可选）
只有当需要在5'端具有三磷酸结构的小RNA（而不是单磷酸）时，例如在 C中的第二siRNA，才需要该步骤。线虫和哺乳动物中的逆转录病毒感染衍生的miRNA。 RNA连接酶不能连接三磷酸化的5'末端。 RppH酶去除两个末端磷酸盐，产生5'末端的单磷酸酯，然后可以将其连接到5'-衔接子上。
1. 向连接反应中加入1μlRppH酶（NEB，5U /μl）。
2. 在37°C孵育30分钟。
1 st 基于SPRI的尺寸选择
注意：在此步骤中，分子>包含较长RNA种类的60nt，包括tRNA，无论是否与衔接子连接，都与珠子结合，而衔接子连接的sRNA（37-45bp）和游离3'-衔接子（18bp）留在上清液中。磁力分离后，将上清液转移到新管中，同时弃去珠子。
1. ＆nbsp;向20μl连接反应中加入40μl不含RNase的H 2 O，最终体积为60μl。＆nbsp;
2. 加入67μlAgencourtAmpure XP珠粒和78μl100％异丙醇，得到最终浓度为7.5％PEG和38％异丙醇（关于拥挤剂PEG和异丙醇浓度的解释见下表2）。＆nbsp;
3. ＆nbsp;通过上下移液6-8次或轻轻涡旋混合均匀。＆nbsp;
4. 在室温下孵育5分钟。将反应管放在磁铁架上，让珠子静置7分钟。＆nbsp;
5. ＆nbsp;小心地将上清液转移到新的1.7 ml管中（丢弃珠子）。
  注意：
  1. Agencourt Ampure XP是含有20％PEG的溶液中的顺磁性SPRI珠粒。
  2. 尺寸选择的最佳条件取决于被分离的片段的长度。优化上述条件，用于从fragments小鼠中分离衔接子连接的sRNA（37-45bp）。 60 bp。如果使用较长的RNA或/和使用不同长度的自定义适配器准备库，请选择1 st 大小选择步骤的最佳条件使用下面附录协议中的表2。＆nbsp;
  3. ＆nbsp; Beckman目前生产两种类型的SPRI珠子：Ampure XP和SPRI-select。两个珠子都是20％PEG。 SPRI-select不含RNase认证，并通过更严格的质量保证（QA），以确保重复性，但是，它们更昂贵。在我们手中，两种珠子类型产生相同的结果。
  4. 由于精确度很重要，请避免遗留。
  5. 将SPRI珠子分装到1.7 ml管中以防止污染（1 ml珠子足以容纳3个库）。
2 nd 基于SPRI的尺寸选择
注意：在此步骤中，衔接子连接的sRNA（37-45nt）与珠子结合，而游离sRNA（19-27nt）和3'-衔接子（18nt）留在上清液中。磁力分离后，除去上清液并丢弃，同时从珠子上洗脱接头连接的sRNA。
1. 向前一步骤的上清液中加入86μlAgencourtAmpure XP珠粒和144μl100％异丙醇，得到最终浓度为7.5％的PEG和51％的异丙醇。＆nbsp;
2. 通过上下移液6-8次或轻轻涡旋混合均匀。＆nbsp;
3. 在室温下孵育5分钟。
4. 将试管放在磁铁架上，让珠子静置7分钟。＆nbsp;
5. 小心取出并丢弃澄清的上清液。＆nbsp;
6. 按照下面的洗涤和洗脱方案进行。＆nbsp;
7. 在19μl无RNase的H 2 O中洗脱。
注意：大小选择的最佳条件取决于被分离的片段的长度。上述条件被优化用于分离连接产物与19-27nt长和18nt长3'-衔接子的非连接sRNA。如果使用较长的RNA或/和使用不同长度的自定义适配器准备库，请选择2 nd 基于SPRI的大小的最佳条件 - 使用下面附录中的表2选择步骤。
洗涤和洗脱方案
1. 将试管置于磁铁架上，加入500μl85％非变性乙醇（新鲜由100％乙醇制成），不会干扰珠子。
2. 在室温下孵育30秒。＆nbsp;
3. 小心取出乙醇，不要打扰珠子并丢弃。
4. 重复乙醇洗涤。
5. 让珠子风干5分钟。吸出残留的乙醇，再让其干燥2分钟。在进行洗脱之前，确保没有残留的乙醇。
6. 从磁铁支架上取下试管，直接在珠子上加入所需体积的分子生物级无RNase水。＆nbsp;
7. 通过移液整个体积轻轻混合10次。＆nbsp;
8. 在室温下孵育2分钟。
9. 简要地旋转下来。
10. 将微管放在磁力架上，让珠子静置2分钟或直到上清液完全变清。＆nbsp;
11. 将所需体积的含有小RNA的澄清上清液转移到新的1.7ml微量管中。
注意：在方案中，始终使用新鲜配制的85％乙醇并保持管道关闭。由于蒸发导致的乙醇浓度降低可能导致短分子从珠子中分离。
结扎5'适配器
注意：在ATP存在下，T4 RNA连接酶1催化3'-连接的sRNA和5'-衔接子之间的连接反应。
1. 结合
2. 通过上下移液6-8次或轻轻涡旋混合均匀。
3. 在72°C孵育3分钟。
4. 直接转移到冰上2分钟。＆nbsp;
5. 简要地旋转下来。
6. 准备结扎组合：
7. 涡旋并旋转连接混合物。
8. 用小RNA样品向管中加入11μl连接混合物。＆nbsp;
9. 在37°C孵育1小时。
10. 在95°C孵育30秒。
11. 直接转移到冰上2分钟。
12. 简要地旋转下来。

阻断寡核苷酸与游离的3'-衔接子杂交，将其转化为dsDNA，而dsDNA不是RNA连接酶的底物，因此阻止了衔接子二聚体的产生。
将样品加热至95°C以释放可能与与小RNA结合的3'-接头退火的阻断寡核苷酸。通过SPRI分离除去游离寡核苷酸。如果不释放和去除，寡核苷酸可能在RT步骤和PCR反应期间与反向引物竞争（寡核苷酸被阻断，因此不会产生任何产物，但产量可能受损）。
等分ATP以防止其降解。在工作台解冻ATP解决方案而不是掌握。

3 rd 基于SPRI的尺寸选择
注意：在此步骤中，3'-5'连接的小RNA（64-72 nt）与珠子结合，而适配子二聚体（45 nt），游离5'-衔接子（27 nt）和阻断寡核苷酸（ 18 nt）留在上清液中。磁力分离后，除去上清液并丢弃，同时从珠子上洗脱3'-5'连接的sRNA。
1. 向20μl连接反应中加入20μl不含RNase的H 2 O，最终体积为50μl。＆nbsp;
2. 加入68μlAgencourtAmpure XP珠粒和64μl100％异丙醇，得到最终浓度为7.5％的PEG和35％的异丙醇。＆nbsp;
3. 通过轻轻地上下移液10次混合均匀。
4. 在室温下孵育5分钟。＆nbsp;
5. 将管放在磁铁架上，让珠子静置10分钟。
6. 小心取出并丢弃澄清的上清液。＆nbsp;
7. 按照上述洗涤和洗脱方案（程序F）进行。＆nbsp;
8. 在15μlH 2 O中洗脱。＆nbsp;
9. 将12.5μl3'-5'连接的小RNA转移到PCR管中。
逆转录
注意：下面的RT协议与qScript Flex cDNA合成试剂盒（Quanta）兼容。如果使用另一个RT试剂盒，请按照试剂盒的说明进行操作。在我们的手中，Invitrogen Superscript III和Superscript II导致产量较低。
1. 加入含有12.5μl3'-5'连接的小RNA的试管：
2. 轻轻地上下移动整个音量6-8次。＆nbsp;
3. 简要地旋转下来。
4. 转移到PCR机器。
5. 在65°C孵育5分钟。＆nbsp;
6. 冷却至42°C。
7. 在42°C下加入样品：
8. 轻轻地上下移动整个音量6-8次。＆nbsp;
9. 在42°C孵育60分钟。
10. 在85°C孵育5分钟。＆nbsp;
11. 冷却至10°C。
12. 继续进行PCR扩增。
注意：
1. GSP Enhancer是qScript Flex cDNA合成试剂盒的一个组件，用于使用特异性引物进行RT。＆nbsp;
2. 样品可以在-20°C下保存长达一周。
＆NBSP;
先导cDNA扩增
注意：此步骤的目的是确定最佳扩增循环数。在校准系统后，可以省略导频PCR步骤。在这种情况下，使用已知的最佳循环数直接执行主PCR。＆nbsp;
1. 结合PCR管：
2. 进行23个循环的PCR。＆nbsp;
3. 循环后暂停热循环仪：11,14,17,20和23;打开试管而不将它们从循环仪中取出并取出7μl进行分析。
4. PCR条件：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：200px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>98°C
  30秒
  
  周期1-4
  98°C
  10秒
  50°C
  30秒
  72°C
  15秒循环5-20
  98°C
  10秒
  64°C
  30秒
  72°C
  15秒 72°C
  2分钟
  
  10°C
  保持
注意：

如果使用较小的起始RNA量，可以提高循环次数。
等分dNTP以防止冻融循环降解。＆nbsp;
RT产品可构成不超过PCR反应的1/10体积。

先导凝胶电泳
注意：可以通过TapeStation / Bioanalyzer检查样品。
1. 施用3.0％琼脂糖/ TBE凝胶。＆nbsp;
2. 加载5μl每一个取出的样品。
3. 在80 V下运行样品1.5小时。
4. 拍张照片。
注意：
1. 使用紫色或橙色加载染料（NEB），因为它们不会产生遮盖文库的紫外可见色带。
2. 使用TBE缓冲区代替TAE，因为它可以更好地分辨小碎片。
PCR产物的评估
注意：评估PCR产物以确定主PCR的最佳PCR循环数。最佳循环次数可以产生清晰可见但不太厚/涂抹的产品带和最佳的库/伪影带比例（典型的PCR结果见图1）。
可能的PCR产物：

注意：截短的引物二聚体起源于RT或PCR期间反向引物与随机8N序列之一的退火。它缺少条形码和8N序列的一部分。

图1.Pilot PCR电泳的实例。 A.从1μg从 C中提取的LMW RNA级分制备的文库。与L4发育阶段同步的线虫蠕虫被扩增11,14,17和20个周期。 B.从1μg从 C中提取的总RNA制备的文库。与L4发育阶段同步的线虫蠕虫被扩增14,17,20和23个周期。将5μl每种扩增产物在3％琼脂糖-TBE凝胶上电泳。 sRNA Library产品用红色箭头表示。从（A）中的第11周期和（B）中的第14周期开始可见约130bp的文库产物。上部~270bp的条带来自snRNA，下部的93bp条带来自截短的衔接子 - 二聚体。基于这些结果，主PCR的所选循环数对于文库（A）是14个循环，对于文库（B）是17个循环。
主要cDNA扩增
如上所述制备PCR反应并以预定的最佳循环数进行扩增。
注意：如果跳过试验PCR，在扩增后取一份等分试样进行质量检查，然后进行文库纯化。
清洁PCR产品
注意：
1. 除引物二聚体外，大多数污染条带可通过使用20％PEG的SPRI珠粒进行常规双面尺寸选择而有效去除（典型清洁输出见图2）。
2. 通过SPRI珠子低效去除105bp长的引物二聚体。引物二聚体的低水平污染是可以接受的，但是如果引物二聚体带很突出，我们建议通过凝胶提取来清洁PCR产物。
清洁SPRI珠子
1. <带的去除> 200 bp
  1. 将50μlPCR产物转移至1.7ml管中。
  2. 添加珠子如下：
    1. 对于主要受较高波段（x1.4V，x2.0V）污染的文库，添加70μl。＆nbsp;
    2. 对于主要受较低波段（x1.2V，x1.8V）污染的文库，加入60μl。
  3. 通过移液10次混合总反应体积。
  4. 在室温下孵育5分钟。＆nbsp;
  5. 将试管放在磁力架上，让珠子静置7分钟。＆nbsp;
  6. 将整个澄清的上清液转移到新管中（丢弃珠子）。
2. 去除带子＆lt; 100 bp
  1. 向上一步骤的上清液中加入30μl珠子。
  2. 通过移液10次混合总反应体积。
  3. 在室温下孵育5分钟。＆nbsp;
  4. 将反应容器放在磁铁架上，让珠子静置7分钟。＆nbsp;
  5. 小心取出并丢弃澄清的上清液。＆nbsp;
  6. 按照上述洗涤和洗脱方案进行（程序F）。＆nbsp;
  7. 用20μlH 2 O洗脱。
3. 清洁之前和之后的sRNA文库的实例显示在图2中。
注意：根据基于SPRI的Beckman-Coulter尺寸选择指南。在第一步，比文库长的条带与珠子结合，而文库保留在上清液中并转移到新管中。在第二步中，加入新批次的珠子以增加PEG浓度，文库与珠子结合，而较短的污染物保留在上清液中并丢弃。相对于核酸溶液的体积计算添加的珠子的体积。为了清理主要受较长条带污染的文库，在1 st 步骤中使用70μl珠子，相当于1.4倍体积50μl核酸溶液（1.4x V）和100μl（70 + 30）珠子在2 nd 步骤对应为了清洁主要受较短波段污染的文库，在1 st 步骤中使用60μl珠子，对应于1.2x V，而2 nd 步骤中的90μl（60 + 30）珠对应于1.8x V。

图2.通过SPRI珠子上的大小选择去除文库污染物。使用SPRI珠子清洁之前（左图：A，C）和之后（右图：B，D）的PCR产品的TapeStation痕迹。从由 C提取的5μg总RNA制备文库。线虫与L4发育阶段同步。上排（A-B）：主要污染物长270bp，占PCR产物总量的~65％。使用1.4x V珠粒然后使用2.0x V珠粒进行双面尺寸选择的清洁可将污染物降低至10％以下。下排（C-D）：主要污染物长93bp，占PCR产物总量的约30％。使用1.2x V珠粒然后使用1.8x V珠粒进行双面尺寸选择清洁可将污染物降低至10％以下。 sRNA文库对应的峰用红色箭头标出。指示峰值大小。标题为“Lower”和“Upper”的外峰分别为25 nt和1,500 nt分子大小的标记。＆nbsp;

在TBE中加入3.5％琼脂糖或3.0％低范围超琼脂糖（Bio-Rad）凝胶。＆nbsp;
电泳样品在80 V下保持2.5小时。＆nbsp;
切除库带并对切片进行加权。＆nbsp;
精细切碎切片（为每个库使用单独的剃须刀）。＆nbsp;
使用凝胶提取试剂盒提取。
注意：在我们的手中，NucleoSpin凝胶和PCR Clean-up试剂盒（Macherey-Nagel）和Gel / PCR DNA片段提取试剂盒（Geneaid）产生了令人满意的产量。
用15μlH 2 O /洗脱缓冲液洗脱。

最终产品验证
1. 测量产品浓度。
2. 通过TapeStation / Bioanalyzer验证库纯度。
图书馆存储
一旦文库准备好进行高通量测序（HTS），将文库存储在-20°C直至使用。

附录协议：微调不同大小的连接分子的结合条件

上述主要方案的大小选择条件适合于连接19-27nt长的小RNA至18nt长3'-衔接子和27nt长5'-衔接子。由于分子的结合效率取决于其大小，如果从较长RNA分子制备文库或如果使用不同长度的定制衔接子，则可能需要对一个或所有大小选择步骤调整条件。

计算需要分离的碎片的大小（例如，参见表1）

表1.上述主要方案中描述的小RNA文库制备过程的成分，中间体和产物的大小。括号中的数字主要对应于miRNA文库，例如人类。
使用表2确定计算尺寸的最佳分离条件。

表2.基于SPRI的短RNA分子分离的条件

该表显示了PEG和异丙醇的给定组合允许分离的片段的近似大小，即，较长片段的最小长度（与珠子结合）和较短的最大长度片段（留在上清液中）。不良结合定义为＆lt; 5％，有效结合定义为> 5％。 50％。注意，PEG浓度总是7.5％，并且H 2 O中的RNA体积是50μl。

表2用法示例
实施例1：在上述方案的3 st SPRI选择步骤中，我们需要将3'-5'-衔接子连接的sRNA（64-72bp）与接头二聚体（45 bp）。根据表2，合适的条件，即，允许有效结合64nt长片段和45nt长片段结合不良的条件是7.5％PEG和35％异丙醇。为了获得这些条件，我们需要通过添加H 2 O使样品达到50μl的体积，然后添加68μl20％PEG（珠粒溶液）和64μl异丙醇。
＆NBSP;如果RNA溶液已经含有PEG，则需要重新计算需要添加的PEG的量。

实施例2：在上述方案的1 st SPRI选择中，根据表2，我们需要将77μl的20％PEG加入到水中的50μlRNA中以获得最终浓度为7.5％PEG。然而，连接反应已经含有4μl的50％PEG，其等于10μl的20％PEG。因此，添加的PEG量必须减少10μl（67μl而不是77μl），并行H 2 O的体积增加10μl（40μl而不是30μl））。
＆NBSP;当首先从较高的带然后从较低的带清洗感兴趣的片段时，必须对PEG和异丙醇进行类似的调整（双侧选择）。

实施例3：在2 nd SPRI选择中，为了从游离衔接子中分离连接的sRNA，需要163μl的20％PEG和222μl异丙醇以获得最终的浓度为7.5％PEG和51％异丙醇。然而，样品已经含有77μl的20％PEG和78μl异丙醇，在1 st 尺寸选择中添加，因此仅需要添加86μl珠子溶液和144μl100％异丙醇。
＆NBSP;对于PEG和异丙醇的每种组合，长于表中列出的最小长度的片段的结合效率将更高，而短于最大长度的片段的结合效率将低于表中出现的值。可以以恢复为代价实现碎片之间更好的分离。如果使用稍低的异丙醇浓度，可以获得纯的更长的片段，而如果在更高的异丙醇浓度下去除更长的片段，则可以通过双侧尺寸选择获得纯的更短的片段。

<实施例4：当分离37nt和58nt长片段时，获得纯的58nt片段，用38％异丙醇进行结合。在此浓度下，58个核苷酸片段中的一些将保持未结合，但不保留37个核苷酸片段。为了获得纯的37nt，首先使用44％异丙醇进行结合。将从溶液中除去所有58个核苷酸片段和一些37个核苷酸片段。接着使用51％异丙醇从溶液中回收剩余的纯37nt长片段。如果希望获得两种片段，则使用41％异丙醇进行第一次结合，使用51％进行第二次结合。在这些条件下，每个碎片都会被另一个碎片轻微污染。有关其他信息，请参阅Fishman et al。（2018）。

测试表2中列出的绑定条件
1. 计算要添加的异丙醇和珠子（在20％PEG中）的量。
  根据等式：
  
  哪里，
  V是总量
  X是核酸溶液的体积
  P是所需的PEG浓度（％） Q是（％）异丙醇的所需浓度
  
  结合溶液的总体积等于：
  1. 分别用P和Q代替所需浓度的PEG和异丙醇，用X代替核酸溶液的体积（我们推荐50μl）并计算结合溶液的总体积（V）。
  2. 接下来，计算分别等于5PV / 100和QV / 100的珠子和异丙醇的体积。
2. 测量绑定效率
  1. 在1.7ml微量管中，在50μlH 2 O中制备100ng合成单链DNA寡核苷酸的溶液。＆nbsp;
  2. 使用上述计算方法确定的体积添加珠子和异丙醇。
  3. 彻底混合。＆nbsp;
  4. 在室温下孵育5分钟。＆nbsp;
  5. 在磁铁架上分开7分钟。
  6. 小心地除去上清液，并根据洗涤和洗脱方案用85％乙醇洗涤珠子两次。在20μlH 2 O中洗脱。＆nbsp;
  7. 使用Qubit ® ssDNA Assay Kit（Molecular probes），通过Qubit ®荧光计测量输入寡核苷酸溶液和洗脱样品的寡核苷酸浓度。根据输入量计算结合效率作为输出寡核苷酸的百分比。

食谱

5x TBE
将54克Tris碱（FW = 121.14）和27.5克硼酸（FW = 61.83）溶于900毫升去离子水中
加入20毫升0.5 M EDTA（pH 8.0）
用去离子水将溶液调节至最终体积1L
注意：
1. pH必须为~8.3（不要调节pH值！）
2. 丢弃是否形成沉淀物。
3. 在1x TBE中制备和运行琼脂糖凝胶。

致谢

我们感谢Technion数学系的Emeritus Vladimir Lin教授帮助他开发计算PEG和异丙醇体积的方程式。
＆NBSP;这项工作由以色列卓越研究中心（I-CORE）计划（ATL的1796/12号中心），以色列科学基金会（ATL的第644/13号和第927/18号授权）和以色列资助癌症研究基金会（ICRF）。该方案改编自Fishman 等人（2018）。

利益争夺

由AF和ATL撰写的题为“用于分离和定量短核酸分子的方法”的PCT专利申请No.PCT / IL2017 / 050761于2017年7月6日由 Technion Research and Developmental Foundation 提交。该申请要求美国临时申请No.62 / 359,245的优先权。

Backes，C.，Meese，E。和Keller，A。（2016）。血液，血清和血浆中特定的miRNA疾病生物标志物：挑战和前景。 Mol Diagn Ther 20（6）：509-518。
Bartel，D。P.（2009）。 MicroRNAs：目标识别和监管功能。 Cell 136 （2）：215-233。
Fishman，A.，Light，D。和Lamm，A.T。（2018）。 QsRNA-seq：一种高通量分析和定量小RNA的方法。 Genome Biol 19（1）：113。
Fuchs，R.T.，Sun，Z.，Zhuang，F。和Robb，G.B。（2015）。基于连接的小RNA测序文库构建中的偏差由衔接子和RNA结构决定。 PLoS One 10（5）：e0126049。
Jost，D.，Nowojewski，A。和Levine，E。（2011）。小RNA生物学是系统生物学。 BMB Rep 44 （1）：11-21。
Kawano，M.，Kawazu，C.，Lizio，M.，Kawaji，H.，Carninci，P.，Suzuki，H。和Hayashizaki，Y。（2010）。通过二聚体消除LNA寡核苷酸减少非插入序列读数，用于小RNA深度测序。 Biotechniques 49（4）：751-755。
Kim，Y。K.（2015）。细胞外microRNAs作为人类疾病的生物标志物。 Chonnam Med J 51（2）：51-57。
Kivioja，T.，Vaharautio，A.，Karlsson，K.，Bonke，M.，Enge，M.，Linnarsson，S。和Taipale，J。（2011）。使用独特的分子标识符计算分子的绝对数量。 Nat Methods 9（1）：72-74。
Lau，N.C.，Lim，L.P.，Weinstein，E.G。和Bartel，D.P。（2001）。一大类微小的RNA，在秀丽隐杆线虫中具有可能的调节作用。 Science 294（5543）：858-862。
Lu，C.，Meyers，B.C。和Green，P.J。（2007）。构建用于深度测序的小RNA cDNA文库。方法 43（2）：110-117。
Lundin，S.，Stranneheim，H.，Pettersson，E.，Klevebring，D。和Lundeberg，J。（2010）。通过并行化大量测序的文库制备来提高通量。 PLoS One 5（4）：e10029。
Mitchell，PS，Parkin，RK，Kroh，EM，Fritz，BR，Wyman，SK，Pogosova-Agadjanyan，EL，Peterson，A.，Noteboom，J.，O'Briant，KC，Allen，A.，Lin，DW ，Urban，N.，Drescher，CW，Knudsen，BS，Stirewalt，DL，Gentleman，R.，Vessella，RL，Nelson，PS，Martin，DB和Tewari，M。（2008）。循环microRNA作为癌症检测的稳定血液标记物。 Proc Natl Acad Sci USA 105（30）：10513-10518。
Nagy，Z.B.，Wichmann，B.，Kalmar，A.，Bartak，B.K.，Tulassay，Z。和Molnar，B。（2016）。从FFPET标本中分离miRNA：miRNA和总RNA分离方法的技术比较。 Pathol Oncol Res 22（3）：505-513。
Paithankar，K。R.和Prasad，K.S。（1991）。用聚乙二醇和乙醇沉淀DNA。 Nucleic Acids Res 19（6）：1346。
Vigneault，F.，Ter-Ovanesyan，D.，Alon，S.，Eminaga，S.，D，C.C.，Seidman，J.G.，Eisenberg，E。和G，M。C.（2012）。 miRNA的高通量多重测序。 Curr Protoc Hum Genet Chapter 11：11.12单元。 1-10。
Youngman，E。M.和Claycomb，J。M.（2014）。从早期课程到新领域：蠕虫是小RNA生物学的宝库。 Front Genet 5：416。