材料和试剂

1.5毫升螺旋盖微管（SARSTEDT，目录号：72.703.600）＆nbsp;
5毫升螺旋盖管（SARSTEDT，目录号：60.9921.524）
25毫升螺旋盖管（SARSTEDT，目录号：60.9922.243）
27 Gx½“1 ml胰岛素注射器（Terumo，目录号：SS * 10M2713A）
铝箔
500毫升瓶顶过滤器，0.2微米孔径（Thermo Fisher Scientific，Nalgene ® Rapid-Flow TM ，目录号：595-4520）
50毫升血清移液器（SARSTEDT，目录号：86.1256.001）
21日龄的BALB / c小鼠（动物资源中心，澳大利亚默多克）
注意：
1. 所有小鼠均进食无OVA饮食。
2. 使用雄性和雌性小鼠。
3. 每次实验n≥6只小鼠。
卵清蛋白冻干粉（Sigma-Aldrich，目录号：A5503，储存于4°C）
氢氧化铝（SERVA，目录号：12261.02，在室温下避光保存）
无菌灌溉用水（Baxter，目录号：2F7113，室温下储存）
氯化钠（NaCl）（Rowe Scientific，目录号：CS10363）
氯化钾（KCl）（Rowe Scientific，目录号：CP2600）
无水磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：RES20908-A704X）
磷酸二氢钾无水（KH 2 PO 4 ）（Amresco，目录号：97062-350）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：320331-500ML）
无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
1 mg / ml卵白蛋白原液（见食谱）
10 mg / ml卵白蛋白原液（见食谱）
用于一只小鼠的卵清蛋白 - 氢氧化铝（OVA-Alum）制剂（见食谱）

设备

外壳笼（Tecniplast，GM500）
500毫升量筒（Rowe Scientific，目录号：GC1276）
100毫升Schott瓶（Sigma-Aldrich，Duran ®，目录号：Z305170）
500毫升Schott瓶（Sigma-Aldrich，Duran ®，目录号：Z305197）
5,000毫升Schott瓶（Sigma-Aldrich，Duran ®，目录号：Z305227）
5,000 ml容量瓶（Sigma-Aldrich，Duran ®，目录号：246787355）
S1移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：9521）
旋转悬架混合器（Ratek，目录号：RSM7DC）
超声波雾化器（DeVilbiss Healthcare，UltraNeb，目录号：U3000）
25 cm x 40 cm有机玻璃气溶胶室（AFM Plastics）
-20°C冰柜

软件

GraphPad Prism（GraphPad软件，版本7.0a）

程序

对21日龄BALB / c小鼠进行腹腔内致敏（图1）
1. 使用27 G x 1/2“1 ml胰岛素注射器吸取200μlOVA-Alum制剂。
2. Scruff鼠标并保持45度向下的角度，头部远离你。
  注意：用于腹腔注射的保持技术应遵循独立的内部程序。
3. 腹膜内缓慢注射全部200μlOVA-Alum制剂（i.p）。
  注意：
  1. 对照小鼠接受假注射200μlPBS。
  2. 每次腹腔注射时始终使用新的无菌注射器。
4. 在致敏后监测小鼠3天或根据个体内部伦理要求监测小鼠。
  注意：OVA致敏小鼠应分别饲养对照小鼠。
腹腔注射35日龄小鼠（图1）
1. 在35日龄时重复步骤A.
2. 在致敏后监测小鼠3天或根据个体内部伦理要求监测小鼠。
42日龄致敏小鼠的卵清蛋白气溶胶攻击（图1）
1. 将致敏小鼠置于与超声波雾化器连接的有机玻璃气溶胶室中，库存密度≤10。
  注意：不要过度拥挤有机玻璃气溶胶室。这可确保所有小鼠都接受等效的OVA气溶胶剂量。
2. 向超声雾化器中加入1x 25 ml等份的10 mg / ml OVA溶液。
  注意：对照小鼠接受PBS气溶胶攻击。
3. 使用以下设置打开超声波雾化器：
  1. 云设置：4
  2. 风扇设置：3
  3. 运行时间：30分钟
4. 在30分钟10mg / ml OVA气溶胶攻击后，将小鼠放回其壳体笼中。
5. 使用新鲜解冻的10mg / ml OVA溶液等分试样在第43和44天重复OVA气溶胶攻击。
图1.腹膜内OVA明矾注射和OVA气溶胶挑战的时间表

数据分析

正如最初的研究文章（Mincham et al。，2018）所详述的那样，成功的早期卵白蛋白致敏和气溶胶攻击在临床上可通过被动皮肤过敏反应测定的OVA特异性血清免疫球蛋白E水平升高得到证实。测定（原始文章中的图1A），增强的炎性细胞群向包含嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞和淋巴细胞的气道的渗透（原始文章中的图1B）和乙酰甲胆碱激发后的气道高反应性（原始文章中的图1C）。成功的早期卵清蛋白致敏和气溶胶攻击还伴有肺中Th2相关细胞因子白细胞介素（IL）-5水平升高（图2A）和气道引流淋巴结中IL-4和IL-5水平升高（图2B）。

代表性数据：

图2.成功早期卵白蛋白致敏和气溶胶攻击后Th2细胞因子升高。 A.早期OVA致敏和气溶胶攻击小鼠的外周肺匀浆中白细胞介素（IL）-5水平升高。 B.早期OVA致敏和气溶胶攻击小鼠的气道引流淋巴结（ADLN）匀浆中IL-4和IL-5水平升高。数据显示n≥4个独立实验的平均值±SEM。使用Student's t -test确定统计显着性，并表示为* P ＆lt; 0.05，** P ＆lt; 0.01，**** P ＆lt; 0.0001。

笔记

将OVA冻干粉添加到无菌水中进行灌溉时要温和。不要搅拌溶液以加速溶解速率，因为这会导致OVA变性。
过滤时轻轻倒入OVA溶液。快速浇注将导致OVA变性。
在最初的研究文章（Mincham et al。，2018）中，在最终的OVA气溶胶攻击后24小时对所有小鼠进行尸检。然而，该方案可用于在最终OVA气溶胶攻击后的任何时间点评估过敏性气道炎症。

食谱

无菌磷酸盐缓冲盐水（制成5升）
1. 溶解43.9g NaCl，1g KCl，5.75g Na 2 HPO 4 ，1g KH 2 PO 4 在5,000ml容量瓶中加入5,000ml无菌水，加入0.2ml HCl
2. 溶解后，使用500 ml瓶顶过滤器将PBS溶液过滤到无菌的5,000 ml Schott瓶中
3. 将无菌PBS溶液等分成500ml等分试样
1mg / ml卵清蛋白原液
1. 通过将冻干的OVA粉末置于水表面上并使其在室温下缓慢溶解，将0.1g OVA冻干粉末溶于100ml无菌水中用于冲洗。不要搅拌溶液（注1）
2. 溶解后，使用500 ml瓶顶过滤器将1 mg / ml OVA溶液过滤到无菌100 ml Schott瓶中（注2）
3. 将无菌1 mg / ml OVA溶液分装成1 ml等分试样（1.5 ml螺帽微管）
4. 储存在-20°C
10mg / ml卵清蛋白原液
1. 将5g OVA冻干粉末溶解在500ml无菌水中用于冲洗，方法是将冻干的OVA粉末置于水表面上，并使其在室温下缓慢溶解。不要搅拌溶液（注1）
2. 溶解后，使用500 ml瓶顶过滤器将10 mg / ml OVA溶液过滤到无菌500 ml Schott瓶中（注2）
3. 使用50 ml血清移液管和S1移液器填充物（25 ml螺旋盖管）将无菌10 mg / ml OVA溶液分成25 ml等分试样。
4. 储存在-20°C
用于一只小鼠的卵清蛋白 - 氢氧化铝（OVA-Alum）制剂
1. 对于每只小鼠，将20μl的1mg / ml OVA溶液在180μl氢氧化铝中乳化，得到最终浓度为20μgOVA和1.3mg氢氧化铝，总体积为200μl。根据需要增加致敏小鼠的总数
2. 将含有OVA-Alum制剂的管（5ml螺旋盖管）包裹在铝箔中，并使用旋转悬浮混合器以20rpm旋转1小时

致谢

作者要感谢Telethon Kids Institute Bioresources工厂的动物技术人员。利用该协议的原始研究文章（Mincham et al。，2018）由澳大利亚国家健康与医学研究委员会资助。

利益争夺

作者声明与此工作无关的财务或非财务竞争利益。

伦理

与该协议相关的所有动物实验均由Telethon Kids Institute动物伦理委员会正式批准，该委员会根据澳大利亚国家健康与医学研究委员会制定的关于科学研究中动物护理和使用的指南进行操作。

参考

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