材料和试剂

Finntip移液器吸头（Finntip Flex 10,200和1,000）
1.5 ml微量离心管（VIOLAMO，F-1.5，目录号：1-1600-01）
拟南芥野生型植物（生态型：Col-0）
拟南芥突变体植物（生态型：Col-0）
液氮
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（Nacalai Tesque，目录号：GR35406-91）
c完成 TM ，Mini，Protease Inhibitor Cocktail（Roche，目录号：4693159001）
Bio-Rad蛋白质分析试剂盒（Bio-Rad，目录号：5000001ja）
FOCUS TM 蛋白质烷基化（TaKaRa，目录号：GA503）
碘乙酰胺（IAA）（Sigma-Aldrich，目录号：I1149-5G）
三氯乙酸溶液（TCA），100％（w / v）（Nacalai Tesque，目录号：SP06275-24）
丙酮（Nacalai Tesque，目录号：SP09888-85）＆nbsp;
FOCUS TM 蛋白质还原剂（TaKaRa，目录号：GA501）
三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）（Nacalai Tesque，目录号：SP06342-21）
单溴二甲双胍（mBB）（东京化学工业，目录号：B4220）
甘油（Nacalai Tesque，目录号：SP17045-94）
溴酚蓝（BPB）（Nacalai Tesque，目录号：B-2609）
甘氨酸（Nacalai Tesque，目录号：SP17141-24）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Nacalai Tesque，目录号：SP08933-34）
蛋白质提取缓冲液（见食谱）
IAA解决方案（见食谱）
SDS-PAGE样品缓冲液（参见食谱）
SDS-PAGE缓冲液（见食谱）

设备

移液器（Thermo Fisher Scientific，Finnpipette TM F2）
软木钻孔机（4.0毫米，孔内径）
常规的杜瓦瓶
Vortexer（科学工业，Vortex-Genie 2）
均质器研杵（VIOLAMO，F-1.5，目录号：1-2955-02）
冷冻微量离心机（TOMY，MX305）
吸收光谱仪（Thermo Fisher Scientific，Multiskan TM GO）
Mini-PROTEAN Tetra系统（Bio-Rad，目录号：1658004ja）
Mini-PROTEAN TGX凝胶（Bio-Rad，目录号：456-1095）
电源（ATTO，目录号：AE-8135）
紫外透射仪（Maestrogen，型号：UV-01）
黄色滤光片（Kenko，Black＆amp; White Filter，Y2 Professional，λ cut-on 470-480 nm）
常规数码相机带罩（RICHO，WG-4）

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij// ）

程序

蛋白质提取
1. 将新鲜制备的叶盘（10-50mg）用软木钻孔器在1.5ml微量离心管中冲出，并立即在Dewar容器中的液氮中冷冻。五片叶盘的估计平均重量应约为10毫克。＆nbsp;
2. 用均化器研杵在微量离心管中研磨样品，并在冰上每50mg样品加入200μl冰冷的蛋白质提取缓冲液（在使用前立即制备，配方1），然后进行样品裂解。
  注意：确保不溶解样品。我们建议在液氮存在下而不是在冰上研磨样品。在拟南芥叶盘的情况下，很容易在几秒钟内获得完全均质的样品。＆nbsp;
3. 在14,000 x g ，4℃下离心10分钟。
4. 将上清液转移到新的1.5ml微量离心管中以除去样品碎片。
蛋白质测量
1. 通过用4倍体积的蒸馏去离子（DDI）水稀释1倍体积的染料试剂浓缩物，制备用于Bio-Rad蛋白质测定的染料。
2. 分别在198和195μl稀释的染料试剂中加入2和5μl蛋白质提取物。
3. 5分钟后，测量595nm处的吸光度，并用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒（0.2至2.0mg / ml）中的蛋白质标准II（BSA）估算蛋白质浓度。
硫醇烷基化
1. 用提取缓冲液将蛋白质浓度调节至1.0mg / ml，并将几个样品合并，在单个管中制备1.5ml蛋白质提取物。
2. 将溶液分成三个1.5ml微量离心管。每管含有500μl提取物，每种用于测定蛋白质提取物中的游离硫醇（管A），二硫键（管B）和总硫醇（管C）。所有管子都应保存在冰上直至使用。
  注意：对于所有实验，我们强烈建议从单一蛋白质提取物开始，以区别性地检测蛋白质中的游离硫醇，二硫键和总硫醇，以最大限度地减少样品变异。
3. 向管B和C中加入2.5μlFOCUS TM 烷基化缓冲液，并涡旋10秒。
4. 仅在管B中加入25μl0.4MIAA（在使用前立即制备，配方2）以检测二硫键。＆nbsp;
5. 孵育管B和C，在室温下（约23℃）不摇动，在黑暗中孵育30分钟。
蛋白质纯化
1. 向管B和C中加入等体积的冷20％（w / v）TCA溶液。
2. 将管在14,000 x g ，4℃下离心30分钟。
3. 去除上清液，保持蛋白质颗粒完整。
4. 通过用500μl冷丙酮洗涤沉淀两次来除去TCA并保留沉淀。
二硫化物还原
1. 通过将2.5μlFOCUS TM 还原剂缓冲液和10μlFOCUS TM 蛋白质还原剂（或DDI水中的250mM TCEP）加入487.5μlDDI水中来调节蛋白质还原溶液。
2. 向管B和C中加入50μl还原溶液，然后通过轻轻地上下移液悬浮颗粒。这里，颗粒没有完全溶解。
3. 将管在55°C孵育1小时。每10分钟涡旋10秒并确认孵育后沉淀完全溶解。
mBB标签
1. 向管A，B和C中加入25μl60mMmBB溶液。
  注意：TCEP可能参与mBB的脱卤作用，可能会削弱溶液中荧光标记的效率（Graham 等，2003）。确保标签溶液中的mBB浓度高于TCEP。
2. 在室温（约23°C）孵育15分钟。
3. 为了去除多余的未反应的mBB，向管A，B和C中加入等体积的冷20％（w / v）TCA溶液。
4. 将管在14,000 x g ，4℃下离心30分钟。
5. 去除上清液，保持蛋白质颗粒完整。
6. 通过用500μl冷丙酮洗涤沉淀两次来除去TCA并保留沉淀。
分离标记的蛋白质
1. 将沉淀悬浮于10-25μlSDS-PAGE样品缓冲液中（可在室温下储存1周，配方3）并煮沸3分钟。
2. 在Mini-PROTEAN Tetra系统中组装Mini-PROTEAN TGX凝胶并倒入SDS-PAGE缓冲液（可在室温下储存1个月，配方4）。
3. 将煮沸的样品（相当于20-40μg蛋白质）加载到样品孔中。
  注意：每管蛋白质的初始量约为50μg。根据实验室中的一些试验实验调整并确定装载量。我们建议用约20μg蛋白质设置SDS-PAGE的实验重复，例如，通过将沉淀重悬于25μlSDS-PAGE样品缓冲液中获得10μl溶液的重复。＆nbsp;
4. 在100 V下开始电泳运行，并在样品经过所需距离后停止。
蛋白质可视化
1. 将凝胶置于UV透射仪上并照射凝胶。
2. 使用黄色滤光片获得来自mBB标记蛋白的荧光。
  注意：mBB的激发最大值为394 nm，发射最大值为490 nm。

数据分析

解释野生型（Col-0）和突变体之间的差异是基于使用任何常规软件（例如ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij// ）。
代表性数据表明Col-0和突变体之间的R-SH染色中的可比较的条带强度（图2）。然而，仅基于R-SH数据，我们无法评估含硫醇蛋白的氧化还原状态。在这里，R-S-S-R数据显示突变体中条带强度略有增加，“总”数据显示条带强度略有下降（图2），表明突变体具有含巯基蛋白质的氧化气氛。结合的解释清楚地提出了突变体在含巯基的蛋白质中具有氧化气氛的可能性，并且氧化还原状态可能有助于含巯基蛋白质的量的减少。
图3举例说明了几种不同的情况。病例A表示Col-0和突变体之间的R-SH染色的可比较的条带强度。情况B表示R-SH数据，显示突变体中条带强度的降低，情况C表示R-SH数据，表明突变体中条带强度的增加。
在所有这些情况下，可以通过R-S-S-R数据和“总计”数据来改变关于氧化还原状态的解释（比较情况A1至A2，B1至B2，以及C1至C2）。
例如，在案例B1中，证明突变体中条带强度增加的R-S-S-R数据支持基于R-SH数据的解释，表明突变体中的氧化气氛。另一方面，在情况B2中，证明突变体中带强度降低的R-S-S-H数据与基于R-SH数据的假设相反。总（R-SH和R-S-S-R）数据表示突变体具有较少种类的含巯基蛋白质。结合的解释提出了突变体在含巯基的蛋白质中具有与Col-0相当的氧化还原状态的可能性，因此，在情况B2中游离巯基可能减少。
许多拟南芥突变体具有多种蛋白质组，这是由于响应各种调节网络中的突变而进行的全面的蛋白质组重组（图3，案例B2和C1）。为了尽可能减少对含巯基蛋白质氧化还原状态的误解，不仅需要获得R-SH数据，还需要获得R-S-S-R和总巯基数据。

图2.含巯基蛋白质的单溴双（mBB）染色的代表性数据。蛋白质中的游离巯基（R-SH）通过mBB染色检测，无烷基化或还原（IAA： - ，TCEP： - ）。通过mBB染色二硫键（R-S-S-R），然后烷基化和还原（IAA：+，TCEP：+）。仅在还原后用mBB显示总硫醇（R-SH和R-S-S-R）（IAA： - ，TCEP：+）。星号表示Col-0和突变体的不同条带强度。

图3.感兴趣的突变体的代表性解释。单溴二甲双胍（mBB）染色凝胶的代表性图像。在所有情况下，左侧泳道为野生型（Col-0），右侧泳道为突变体。 R-SH和R-S-S-R分别表示蛋白质中的游离巯基和二硫键。

食谱

蛋白质提取缓冲液
30 mM Tris / HCl，pH 7.0，含一片cOmplete TM ，每10 ml含有一小段蛋白酶抑制剂鸡尾酒
IAA解决方案
0.4 M IAA＆nbsp;
SDS-PAGE样品缓冲液
50mM Tris / HCl，pH 7.0
2％（w / v）SDS
5％（w / v）甘油
0.01％（w / v）BPB
SDS-PAGE缓冲液
250 mM Tris
1.92 M甘氨酸
1％（w / v）SDS

致谢

该协议由Hashida 等人（2018）的先前工作进行了调整和修改。 JSPS KAKENHI拨款号17H05714对M.K.Y.支持这项工作。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

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Fahey，R。C.，Newton，G。L.，Dorian，R。和Kosower，E。M.（1981）。生物硫醇的分析：基于使用单溴双甲烷衍生化和分离的皮摩尔水平定量测定硫醇阳离子交换色谱法。 Anal Biochem 111（2）：357-365。
Fenton，S。S.和Fahey，R。C.（1986）。生物硫醇分析：测定二硫化物和硫酯的硫醇组分。 Anal Biochem 154（1）：34-42。
Getz，E.B.，Xiao，M.，Chakrabarty，T.，Cooke，R。和Selvin，P。R.（1999）。巯基还原剂三（2-羧乙基）膦和二硫苏糖醇之间的比较，用于蛋白质生物化学。 Anal Biochem 273（1）：73-80。
Graham，D.E.，Harich，K。C. and White，R。H.（2003）。三（2 - 羧乙基）膦还原脱卤单溴二烯。肛门Biochem 318（2）：325-328。
Hashida，S.N.，Miyagi，A.，Nishiyama，M.，Yoshida，K.，Hisabori，T。和Kawai-Yamada，M。（2018）。铁氧还蛋白/硫氧还蛋白系统在拟南芥的叶绿体NADP状态中起重要作用。 Plant J 95（6）：947-960。＆nbsp;
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