材料和试剂

离心管15,50 ml（SARSTEDT，目录号：62.554.001,62.547.254）
显微镜载玻片（Carl Roth，目录号：1879.1）
培养皿（SARSTEDT，目录号：83.3902）
移液器吸头10μl，20μl，200μl，1,000μl（SARSTEDT，目录号：70.1130,70.116,70.760.002,70.762）
无菌过滤器0.2μm（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
人体皮肤活检（在4°C，1x PBS中保存最多36小时）
2-丙醇（Carl Roth，目录号：9866.1）
Dispase II（中性蛋白酶，II级）（罗氏，目录号：04942078001，储存温度4°C）
Dulbecco改良的Eagle's培养基，高葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D7777-10L，储存温度4°C）
KBM TM 金角质形成细胞生长培养基BulletKit TM （Lonza，目录号：00192060，储存温度4°C）
KCl（Carl Roth，目录号：6781.3）
KH 2 PO 4 （Carl Roth，目录号：3904.2）
Na 2 HPO 4 •12H 2 O（Carl Roth，目录号：N350.1）
NaCl（Carl Roth，目录号：3957.3）
NaOH（Carl Roth，目录号：6771.3）
Seahorse XF Calibrant Solution（安捷伦科技，产品目录号：100840-000）
Seahorse XF细胞Mito压力测试试剂盒（Oligomycin，FCCP，Rotenone / Antimycin A）（安捷伦科技，目录号：103015-100，储存温度-20°C）
10 M NaOH（参见食谱）
1x PBS（见食谱）
酶消化液（参见食谱）
XF检测培养基（见食谱）

设备

剪刀，不锈钢（Carl Roth，目录号：HCX4.1）
海马捕获屏插入工具（安捷伦科技，目录号：101135-100）
Seahorse XF24胰岛捕获FluxPak含有传感器盒和胰岛捕获微孔板（Agilent Technologies，目录号：101174-100）
镊子，不锈钢（Carl Roth，目录号：2687.1）
37°C孵化器，无CO 2 （GFL，目录号：4010）
pH计FiveEasy TM F20（Mettler Toledo，目录号：30266626）
移液器，Eppendorf研究®加10μl，20μl，200μl，1,000μl（Eppendorf，目录号：3123000020,3123000039,3123000055,3123000063）
Seahorse XF24 Flux Analyzer（安捷伦科技，型号：XF24，目录号：100737-100）

软件

Seahorse XF24 Flux Analyzer软件（仪器软件）（Agilent Technologies，Version 1.8.1.1）
Wave（分析软件）（Agilent Technologies，Version 2.6）

程序

分析前一天

从样品管中取活组织检查，先用70％异丙醇洗涤，然后用1x PBS洗涤，除去残留的血液和其他杂质。
在下一步中，去除脂肪和组织（见图1A和1B）。
将活组织切片（见图1B）切成小块（约0.4×0.4cm）（见图1C），并将它们置于15ml离心管中的酶消化溶液中。
将活组织检查储存于4°C酶消化16小时（在非搅拌条件下）。＆nbsp;
在非CO 2 培养箱中测量前一天根据制造商的说明在Seahorse XF Calibrant中对传感器盒进行水合。
打开XF24分析仪，将系统预热至37°C。

图1.活组织检查的准备步骤。：一种。粘附于真皮/表皮的脂肪和结缔组织（箭头）。 B.第一次纯化步骤后的真皮/表皮。 C.用于酶消化的溶液中的分开的活组织检查。 D.与Dispase II孵育后分离的表皮片。 E.使用胰岛捕获屏幕捕获筛选插入工具（Agilent Technologies）。

分析日

准备XF测定培养基并加热至37°C＆nbsp;
在酶消化后，小心地从真皮（镊子）移除表皮并将其置于具有1x PBS的培养皿中（参见图1D）。在该步骤中，重要的是确保基底面向下朝向培养皿的底部。表皮片应放置在捕获屏幕上的生命基底侧。这种方向对于测量至关重要，因为传感器会检测到面向捕获屏幕的一侧（参见图2E）。＆nbsp;
用显微镜载玻片小心地从1x PBS中提起表皮，然后在第二张幻灯片上擦拭表皮（翻过表皮一次）。
用捕获屏幕上的第二张幻灯片擦去皮肤，将其平滑地拉出，然后将捕获屏幕插入工具插入胰岛捕获微孔板（参见图1E）。表皮应覆盖捕获屏幕的整个表面，以确保始终测量相同的表皮区域（参见图2A-2C）。表皮下应该没有气泡（见图2D），因为它们会干扰测量。
用镊子去除井中多余的悬垂皮肤。
将450μlXF测定培养基添加到胰岛捕获微板的每个孔中。
将胰岛捕获微孔板在37℃孵育孵育器（不含CO 2 ）45分钟，以将表皮调节至新培养基。
按照编程加载传感器盒的进样口（参见XF控制器的编程），按照XF分析仪的说明开始校准传感器盒。
校准完成后，将胰岛捕获微孔板放入XF分析仪中并开始测量。
使用海马分析软件Wave进行数据分析。

图2. XF24胰岛捕获微孔板中表皮的显微图像。表皮必须尽可能平坦，基部侧与捕获屏接触，然后放入多孔板中使用捕获屏幕插入工具。氧气消耗的测量发生在标有箭头（A）的环内的表面上。在网中心的环内，不应有孔（B）或气泡（D）。平面安装的表皮，没有气泡，覆盖整个表面并具有正确的方向（C）。具有胰岛捕获微孔板（E）的XF24测量系统的示意性设置（来自Schniertshauer的改良图像等人，，2018）。比例尺= 2毫米。

对XF控制器进行编程
本节描述了用于测量氧消耗速率的XF控制器的各个程序步骤，如图2所示。使用XF测定培养基将应激试剂稀释至终浓度为4μM。 Oligomycin，FCCP和鱼藤酮/抗霉素A的浓度应在各实验条件的初步实验中确定。应同时注入应力试剂应在所有孔中进行。
XF控制器的工作流程：

校准探针
延迟时间：15分钟
第一循环-3次（基础状态）
1. 混合：4分钟
2. 延迟时间：2分钟
3. 测量：3分钟
注射端口A（50μl寡霉素，4μM终浓度）
1. 使用寡霉素阻断ATP合成酶。＆nbsp;
2. 然后将OCR降低到用于合成ATP的氧气量。
第二次循环-6次（ATP连锁呼吸减少）
1. 混合：4分钟
2. 延迟时间：2分钟
3. 测量：3分钟
注射端口B（55μlFCCP，4μM终浓度）
通过FCCP解耦呼吸链允许独立于质子梯度确定最大呼吸和备用呼吸能力。
第三次循环-3次（潜在的解耦呼吸）
1. 混合：4分钟
2. 延迟时间：2分钟
3. 测量：3分钟
注射端口C（60μl鱼藤酮/抗霉素A，终浓度4μM）
在最后一个循环中，通过添加鱼藤酮和抗霉素A来阻断复合物I和II。因此剩余的氧消耗仅取决于非线粒体呼吸。
第四次循环-6次（非线粒体呼吸）
1. 混合：4分钟
2. 延迟时间：2分钟
3. 测量：3分钟
计划结束

数据分析

可以使用Prism 7.04（GraphPad Software，Inc。）分析数据。值表示为平均值±SEM或单个值。建议每个实验组重复5次，包括一次活组织检查。

代表性数据
根据前述步骤测量来自人皮肤活组织检查的表皮组织中的氧消耗速率，显示加入四种应激试剂Oligomycin，FCCP，Rotenone / Antimycin A后的典型过程，如图3所示。

图3.源自人表皮活组织检查的上皮组织中的耗氧率（OCR）。描述在三个注射步骤中注射四种活性成分后的主要阶段的方案。这使得可以确定呼吸链内各个复合物的效率（n = 5，平均值±SEM）。

笔记

我们在此描述的来自人表皮活组织检查的上皮组织中的氧消耗率的测量具有高度可重复性。
手术后，活组织检查应在4°C的PBS中保存最多36小时。在此时间段内进行OCR测量非常重要，因为呼吸参数在此期间后会明显减少。
Oligomycin，FCCP和鱼藤酮/抗霉素A的浓度应在各实验条件的初步实验中确定。其他活组织检查的指示浓度可能不同。在初步研究中，确定了4μM的浓度。与单层细胞培养物相比，较低的浓度显示没有或几乎没有效果。＆nbsp;
因为活组织检查是一种细胞复合物，其中物质需要更长的时间才能穿透整个样本，因此必须使用海马手册中规定的更高浓度和更多测量点。
为了排除光老化效应，应仅比较从相同身体区域获得的活组织检查。来自身体区域的具有高紫外线照射（例如，眼睑）的样本显示出比来自供体的低UV暴露（例如，腹部）的样本平均线粒体呼吸显着降低与年龄相同。

食谱

10 M NaOH
40克NaOH
ad 100 ml ddH 2 O.
1x PBS
8克NaCl
0.20克KCl
2.88 g Na 2 HPO 4 •12H 2 O
1.24克KH 2 PO 4
ad 1 L ddH 2 O，pH 7.4
酶消化解决方案
8 ml KBM TM 金角质形成细胞生长培养基BulletKit TM
4毫升Dispase II
最终浓度2.4 U / ml
XF检测培养基
0.675克Dulbecco's改良Eagle的中高葡萄糖
ad 50 ml ddH 2 O，无菌过滤，pH 7.4

致谢

作者感谢Hug博士，Huth博士，Astfalk博士和Then-Schlagau博士提供的样品供应。他们还感谢Franz Enzmann博士和AlexanderBürkle博士的科学建议。这项工作得到了巴登 - 符腾堡州科学，研究和艺术部以及BMBF-FHprofUnt2012“MitoFunk”[03FH022PX2]的资助。

利益争夺

其中一位作者与德国Bad Homburg的MSE Pharmazeutika GmbH和德国汉堡的Beiersdorf AG签订了咨询合同。

伦理

所有实验均按照赫尔辛基宣言进行，并经德国巴登 - 符腾堡州医学会伦理委员会批准（187-03）。事先通知患者，并书面同意使用他们的样本。

参考

Furda，A。M.，Marrangoni，A。M.，Lokshin，A。和Van Houten，B。（2012）。氧化剂而非烷化剂会导致mtDNA快速丢失和线粒体功能障碍。 DNA修理（Amst） 11（8）：684-692。
Gebhard，D.，Matt，K.，Burger，K。和Bergemann，J。（2014）。作为太阳损伤谱的一部分，短波紫外线引起的损伤不是线粒体功能障碍的主要原因。 J Biochem Mol Toxicol 28（6）：256-262。
Harman，D。（1972）。生物钟：线粒体？ J Am Geriatr Soc 20（4）：145-147。
Schniertshauer，D.，Gebhard，D。和Bergemann，J。（2018）。辅酶Q10可以逆转上皮组织中年龄依赖性的线粒体功能丧失。 J Aging Res 2018：6354680。
Yoshida，T.，Goto，S.，Kawakatsu，M.，Urata，Y。和Li，T。S.（2012）。线粒体功能障碍，是接触电离辐射后持续氧化应激的可能原因。 Free Radic Res 46（2）：147-153。