材料和试剂

细菌生长和生物膜测定
1. 500毫升康宁一次性无菌瓶盖过滤器，0.22微米膜（Fisher Scientific，目录号：09-761-112）
2. 带瓶盖的500毫升可重复使用玻璃介质瓶（Fisher Scientific，目录号：FB800500）
3. 100 x 15 mm培养皿（Fisher Scientific，目录号：S43570）
4. 1μl接种环（DB Difco，目录号：BD 220215）
5. 15毫升锥形管，用于培养微需氧菌（Fisher Scientific，目录号：50-153-5104）＆nbsp;
6. 一次性圆底无框玻璃管（Fisher Scientific，目录号：14-962-15A）和盖（Fisher Scientific，目录号：14-957-91）
7. 比色皿，标准：聚苯乙烯（Fisher Scientific，目录号：14-955-127）
8. 1.5 ml微量离心管（Fisher Scientific，目录号：02-682-002）
9. 移液器吸头
10. pH条（EMD Millipore，目录号：1.09542.0001）
11. Catheter-Nalgene 50硅胶管（Nalgene Brand Products，目录号：80600030）
12. 96孔聚苯乙烯板（Grenier Bio-One CellSTAR，目录号：655180）
13. 96孔微量滴定板（康宁，目录号：3788）
14. Axygen Scientific微孔板预灭菌密封胶带（Fisher Scientific，目录号：14-222-044）
15. 细菌种类：粪肠球菌 OG1RF（ATCC 47077）
16. 双去离子水
17. 1x磷酸钠盐水（Sigma-Aldrich，目录号：P3813）
18. 0.1 N盐酸溶液（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：2104）
19. 0.1 N氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：SX0607C）
20. 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
21. 琼脂，细菌级（BD Difco，目录号：B281230）
22. 不含纤溶酶原和血管性血友病因子的人纤维蛋白原（13-14 mg / ml浓度随每批次而异）（酶研究实验室，目录号：FIB 3）
23. 脑心浸液肉汤（BHI）（BD公司，目录号：B237500）或任何其他媒介，以满足您的细菌物种的需求＆nbsp;
24. 合并的人尿（从至少三名健康女性捐献者[需要内部审查委员会批准]或商业上可获得的新鲜尿液中收集）。
  注意：尿液应该是新鲜的，并且在冷藏下保存不超过3天。
25. BHI液体培养基（见食谱）
26. BHI-琼脂平板（见食谱）
27. 尿（见食谱）
评估导管上的生物膜形成
1. 12孔聚苯乙烯微孔板（Fisher Scientific，目录号：08-772-50）
2. 铝箔
3. 10％中性缓冲福尔马林（Fisher Scientific，目录号：22-046-361）
4. 20％叠氮化钠溶液（Sigma-Aldrich，目录号：S-2002）
5. Tween-20（西格玛奥德里奇，目录号：P1379）
6. 甲基α-d-甘露糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：M6882）
7. 兔抗肠球菌抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录号：ab68540）或其他商业上可获得的抗肠球菌抗体
8. IRDye 680LT山羊抗兔（LI-COR Biosciences，目录号：926-68021）
9. 免疫染色解决方案（见食谱）
  1. 阻止解决方案
  2. 洗液
  3. 稀释缓冲液
  4. 一抗溶液
  5. 二抗溶液
生物膜在微孔板上的评估
1. 纸巾
2. 试剂储存器（Fisher Scientific，目录号：14-387-065）
3. 结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C0775）
4. 乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）
5. 解决方案（见食谱）
  1. 0.5％结晶紫溶液
  2. 33％的醋酸

设备

钳子
Heraeus Multifuge X3R冷冻离心机（VWR，目录号：75004516）或具有类似功能的任何冷冻离心机
Spectra Max ABS Plus分光光度计（Molecular Devices，目录号：ABS PLUS）或具有类似功能的任何分光光度计
Branson Ultrasonics TM Bransonic TM CPX-sonicator（waterbath sonicator）（Fisher Scientific，目录号：15-337-419）或具有类似功能的任何水浴超声波仪
Odyssey CLx成像系统（LI-COR，目录号：9140-01）
试管架（Fisher Scientific，目录号：14-809-62）或任何标准试管架
VWR微生物培养箱（VWR，目录号：51030017）或任何标准微生物培养箱
带紫外线灯的生物安全柜（Thermo Fisher，目录号：1395）或具有类似功能的任何标准设备
Vortexer（Fisher品牌，目录号：02-215-418）或任何标准涡流
高压灭菌器（Getinge，目录号：633LS）或任何标准高压灭菌器

软件

CLX image studio（LI-COR，目录号：9140-510）
GraphPad Prism（GraphPad Software LLC）

程序

该协议的各个步骤总结在图1中。

图1.协议布局

细菌生长
1. 使用无菌接种环将细菌种类划线在BHI琼脂平板上。
2. 在37°C孵育细菌过夜。
3. 将10ml BHI培养基加入15ml锥形管中。
4. 使用无菌接种环，选择一个 E. f aecalis 殖民地接种媒体。
5. 将细菌培养物在37℃下在静态条件下孵育18小时（目标OD 600 = 1.0）。
导管和微孔板制备
导管
1. 切割1厘米的硅胶管。
2. 切成1厘米的一半（图2）。
  
  图2. 1 cm硅胶片的制备。 A.硅胶管。 B. 1厘米硅胶片。 C. 1厘米的碎片。
3. 将得到的碎片放在开放的培养皿中。
4. 隔夜紫外线杀菌（生物安全柜标准紫外线设置）
5. 使用无菌镊子将每个硅胶片转移到无菌的5毫升玻璃试管中并盖上盖子。
  注意：纤维蛋白原是一种粘性蛋白质。因此，使用玻璃管会降低纤维蛋白原与管壁的结合。
6. 在37℃下解冻纤维蛋白原储备溶液，并将1x PBS溶液置于37℃。纤维蛋白原在体温下可溶;因此，将其保持在37°C，直到将其添加到硅胶片中。＆nbsp;
7. 在1x PBS中制备100μg/ ml纤维蛋白原的工作溶液。＆nbsp;
8. 将1毫升纤维蛋白原溶液加入含有硅胶片的试管中。＆nbsp;
9. 将硅胶片在4℃下在静态条件下孵育过夜，以使纤维蛋白原包被导管。
的微孔板
1. 将100μl的100μg/ ml纤维蛋白原溶液（步骤B7）分配到96孔聚苯乙烯板（Grenier Bio-One CellSTAR）的每个孔中。＆nbsp;
2. 用无菌板密封带密封板。
3. 将微量培养板在4℃孵育过夜，使纤维蛋白原包被在孔的底部。
文化准备
1. 将过夜培养物（步骤A5）以7,000rpm（7,505 xg ）离心10分钟。
2. 去除上清液。
3. 用10ml 1x PBS溶液重悬细菌沉淀。然后在7,000rpm（7,505 x g ）下再次离心10分钟。通过用10ml 1x PBS溶液重悬细菌沉淀来洗涤细菌细胞。重复此步骤3次。
4. 将1 ml细菌溶液稀释到9 ml 1x PBS溶液中（1:10稀释）。该步骤对于确保测量的准确性是必要的。
5. 取1 ml稀释溶液，放入比色皿中。＆nbsp;
6. 使用分光光度计测量光密度（OD 600 ）。
  注意：将OD 600 值乘以10（稀释因子）以获得培养物的最终光密度。＆nbsp;
7. 将培养物稀释至最终OD 600 1.0。
8. 用20毫克/毫升的BSA补充新鲜过滤灭菌的尿液（见配方2）。＆nbsp;
9. 使用瓶盖过滤器对补充的尿液进行过滤消毒。＆nbsp;
10. 将1：100标准化培养物（步骤C7）接种到补充有BSA的过滤灭菌尿液中。＆nbsp;
导管依赖Fg的生物膜设置
1. 在4°C温育过夜后，取出含有Fg涂层硅胶片的试管（步骤B9）。＆nbsp;
2. 使用1,000μl移液器轻轻吸出纤维蛋白原溶液。＆nbsp;
3. 加入1ml含细菌的尿液（步骤C10）。作为阴性对照，仅用BSA补充的尿液（无细菌）孵育三个Fg包被的片。
4. 将管在37°C的静态条件下孵育24小时（或根据需要）。＆nbsp;
评估导管生物膜
1. 在4℃下孵育过夜后，除去涂有Fg的板（步骤B12）。＆nbsp;
2. 剥掉板密封胶带。＆nbsp;
3. 用移液管轻轻吸出纤维蛋白原溶液。
4. 加入200μl含细菌的尿液（步骤C10）。作为阴性对照，仅用尿液（无细菌）孵育8 Fg包被的孔（一个微孔板柱）。
5. 用无菌盖子盖住盘子。＆nbsp;
6. 将微孔板管在37°C的静态条件下孵育24小时（或根据需要）。＆nbsp;
评估微孔板生物膜
1. 使用1,000μl移液管从管中吸出细菌培养物。
2. 通过在室温下使用1ml 1x PBS剧烈移液来除去未结合的细菌。重复此步骤3次。
通过菌落形成单位评估生物膜形成＆nbsp;

用无菌镊子（从步骤F2）将硅胶片转移到15ml锥形管中。＆nbsp;
加入1毫升1x PBS。＆nbsp;
为了从导管中分离细菌生物膜，在室温下涡旋30秒（最大涡旋速度）。＆nbsp;
在室温（40kHz频率）下将锥形管放入Branson超声波浴中5分钟，并涡旋另外30秒。
取200μl样品，用PBS（1:10）连续稀释。
BHI琼脂平板上的平板稀释液。
将板在37°C孵育过夜。＆nbsp;
量化菌落形成单位（图3）。

在洗涤硅氧烷片后（步骤F2），将它们转移到12孔板中。
通过加入5ml 10％中和的福尔马林溶液20分钟固定硅胶片。
去除福尔马林
加入5ml PBS洗涤碎片（重复3次）。除非另有说明，否则该方案中的所有洗涤均在室温下在静态条件下进行。
通过在室温下（或在4℃下过夜）加入5ml封闭溶液1小时来封闭碎片。
用5ml洗涤溶液洗涤碎片。重复此步骤3次。
加入5毫升一抗溶液。＆nbsp;
在室温下在静态条件下孵育2小时。
用5ml洗涤溶液洗涤碎片。重复此步骤3次。
加入5毫升二抗溶液。用铝箔覆盖板（二抗对光敏感）。
在室温下在静态条件下孵育1小时
用5ml洗涤溶液洗涤碎片。重复此步骤3次。
将碎片转移到新的12孔板中。
让它们干燥过夜。
使用Odyssey成像仪（在700nm近红外区域检测）可视化生物膜（图4）。

在洗涤硅氧烷片后（步骤F2），将它们转移到12孔板中。
让碎片风干。＆nbsp;
加入5毫升0.5％的结晶紫溶液。
在室温下在静态条件下染色10分钟。
用蒸馏水清洗碎片（重复此步骤3次）。
加入1毫升33％乙酸以溶解结晶紫染色。
在室温下在静态条件下孵育15分钟。
将200μl溶解的结晶紫转移到新的微孔板中。
使用读板器定量595nm处的吸光度。作为空白，使用33％的乙酸水溶液。可能需要连续稀释进入读板器的线性范围。＆nbsp;

评估微孔板生物膜

孵育后（步骤E6），翻转平板除去培养物。＆nbsp;
通过将板浸入装满水的小容器中来洗涤未结合的细胞。轻轻摇动盘子并摇出水。重复此步骤3次。
轻轻敲打纸巾以除去残留的液体，使板干燥。
让盘子风干。
加入200μl0.5％结晶紫溶液。
在室温下在静态条件下染色10分钟。
通过将板浸入装满水的容器中进行冲洗。浸没后，剧烈摇动盘子，倾倒液体，然后用纸巾轻拍盘子以除去残留的液体。重复此步骤3次。
加入200μl33％乙酸以溶解结晶紫染色。
在室温下在静态条件下孵育15分钟。
将200μl溶解的结晶紫转移到新的微孔板中。
使用读板器定量595nm处的吸光度。作为空白，使用33％的乙酸水溶液。可能需要连续稀释以落入读板器的线性范围。

数据分析

生物膜相关CFU的分析
1. 记录 10 转换从每个导管中回收的最终细菌计数（n≥3）（图3）。
2. 以线性比例绘制数据并包括算术平均值。＆nbsp;
3. 根据您要比较的组的数量，使用双尾Mann-Whitney U检验或单向ANOVA以及相应的帖子分析log 10 转换后的数据 - 测试比较。
  注意：Log 10 转换是可选的。绘制和分析数据的另一种方法是使用几何平均值和几何标准差在对数刻度上绘制未转换的数据。
  
  图3.通过菌落形成单位（CFU）测量的生物膜的代表性数据。＆nbsp; E之间生物膜形成的比较。粪便＆nbsp; OG1RF（野生型菌株）和锰摄取系统三重突变菌株（ΔefaΔmntH1ΔmntH2），它是一种生物膜缺陷型突变体。进行双尾Mann-Whitney U检验以确定两组之间的显着性（*** P <0.0002）。
通过免疫染色或结晶紫评估生物膜形成的分析
1. 在线性标度上绘制每组（n≥3）的阴性对照（图4）或吸光度（相对于阴性对照）的相对荧光，并包括算术平均值和标准偏差。
2. 使用Mann-Whitney U检验分析数据。
  注意：
  1. 导管上的生物膜形成测定通常不遵循由D'Agostino-Pearson测试确定的正态分布。因此，非参数分析（如Mann-Whitney U检验）比参数ANOVA检验更合适。＆nbsp;
  2. 可以使用ROUT方法识别异常值（建议Q = 1％），如果确认，可以从最终分析中删除。
  图4.通过免疫染色和结晶紫分析生物膜的代表性图像和数据。 A.通过 E可视化导管片上生物膜的形成。粪肠球菌 OG1RF和锰摄取系统三重突变株（ΔefaΔmntH1ΔmntH2）。导管控制是那些仅用尿液（无细菌）孵育的Fg涂层导管。 B.通过相对于导管对照绘制荧光，对OG1RF WT和缺陷突变体之间的生物膜形成进行免疫染色分析。 C.CV染色通过绘制相对于导管对照的吸光度来量化和比较OG1RF WT和缺陷突变体之间的生物膜形成。进行双尾Mann-Whitney U检验以确定两组之间的显着性（*** P <0.0002）。

食谱

媒体
1. BHI液体媒体
  将37克BHI肉汤粉加入1升蒸馏水中混合直至溶液澄清
  高压灭菌20分钟
  在使用前让介质冷却至室温
2. BHI-琼脂平板
  将37g BHI肉汤粉和15g琼脂加入1L蒸馏水中混合直至溶液澄清
  高压灭菌20分钟
  让介质冷却到45°C的温度
  如果需要添加抗生素并混合
  保持培养基温暖，将25毫升培养基倒入培养皿中
尿液
1. 将来自至少三个健康女性供体的尿液汇集（或获得市售的混合尿液）。在研究期间使用相同的尿液批次以保持一致性
2. 将合并的尿液以7,000 rpm（7,505 x g ）离心5分钟以除去沉淀物
3. 使用pH条测量pH，并根据需要使用HCl溶液或NaOH溶液调节至6.5
4. 使用瓶顶过滤器对混合的尿液进行过滤消毒。每次优先使用新鲜尿液。如果不立即使用，将尿液储存在4°C不超过3天。如果观察到沉淀物形成，则以7,000rpm（7,505 x g ）重复离心5分钟
解决方案
1. 阻止解决方案
  1x PBS，含1.5％BSA和0.1％叠氮化钠。保持溶液在4°C
2. 洗涤液
  含有0.05％Tween-20的1x PBS。保持溶液在室温下
3. 稀释缓冲液
  含有0.05％Tween-20,0.1％BSA和0.5％甲基α-d-甘露糖苷的1x PBS。保持溶液在4°C
4. 一抗解决方案
  将1：500的兔抗链球菌组D抗原抗血清加入稀释缓冲液中。每次都准备新鲜
5. 二抗溶液
  将1：10,000的山羊抗兔IRDye 680LT加入稀释缓冲液中。每次都准备新鲜
6. 0.5％结晶紫溶液
  将0.5毫克加入100毫升蒸馏水中。过滤消毒溶液。保持溶液在室温下
7. 33％的醋酸
  将330毫升乙酸加入670毫升蒸馏水中。保持溶液在室温下

致谢

C.C.W.得到了美国心脏协会GSA Predoctoral Fellowship 16PRE29860000，J.A.L。的支持。由国家过敏和传染病研究所AI135158，A.L.F.M。提供支持。得到了圣母大学的启动资金支持。
对Nallapareddy 等人（2011）和Flores-Mireles 等人（2014）所做的先前研究的特别肯定。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

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