材料和试剂

移液器吸头（海王星，1,000μl，200μl，20μl，10μl，不含DNase- / RNase＆amp; Biozym，优质吸头1000μl，200μl，10μl）
1.5 ml微量离心管（Sarstedt AG＆amp; Co.KG，SafeSeal tube，目录号：72.706）
0.2 ml微量离心管（Greiner Bio-one，Sapphire PCR tube，目录号：683271）
硬壳PCR板96孔，薄壁（Bio-rad，目录号：HSP9601）
原代人肝细胞（PHH）（从汉诺威医学院获得或在海德堡大学医院制备）（PHH的可能商业供应商是Lonza，Biopredic，BioIVT，ThermoFisher，但对HBV的易感性可能不同），HepaRG NTCP 和HepG2 NTCP 细胞系（Qu et al。，2018）
质粒pSHH2.1（Cattaneo et al。，1983），可根据相应作者的要求提供
引物：
引物p1040：5'-GTGGTTATCCTGCGTTGAT-3'
引物p1996：5'-GAGCTGAGGCGGTATCT-3'
p1578：5'-CCGTGTGCACTTCGCTTCA-3'
p1867：5'-GCACAGCTTGGAGGCTTGA-3'
p1583：5'-TGCACTTCGCTTCACCT-3'
p2301：5'-AGGGGCATTTGGTGGTC-3'
探索
探针p1085：5'-FAM-AGTTGGCGAGAAAGTGAAAGCCTGC-TAMRA-3'
胰蛋白酶[0.25％胰蛋白酶-EDTA（1x）]（Invitrogen，Gibco，目录号：25200-056），4°C
NucleoSpin Tissue kit（Macherey-Nagel，目录号：740952.250）
Buffer T1（Macherey-Nagel，目录号：740940.25）
蛋白酶K（Macherey-Nagel，目录号：740506），-20℃
Buffer B3（Macherey-Nagel，目录号：740920）
绝对乙醇（VWR化学品，目录号：20821.330）
Buffer BW（Macherey-Nagel，目录号：740922）
Buffer B5 Concentrate（Macherey-Nagel，目录号：740921）
T5外切核酸酶（New England Biolabs，目录号：M0363），-20℃
NEBuffer 4（New England Biolabs，目录号：B7004），-20℃等分试样
PerfeCTa qPCR Toughmix（Quanta Biosciences，目录号：95112-012），-20°C等分试样
SYBR Green Supermix（Bio-Rad，目录号：172-5121），-20℃等分试样
Myrcludex B（Bachem），可根据相应作者的要求提供，-80°C等分试样
重组人干扰素-α-2a（PeproTech，目录号：300-02AA）， - 80°C等分试样
人干扰素-α-2a（PBL分析科学，目录号：11100-1），等分试样为-80°C
无核酸酶水（B. Braun Melsungen，Aqua ad iniectabilia Braun）
NaCl（Carl Roth GmbH，目录号：9265.2）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：31248）
Na 2 HPO 4 •2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：04272）
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
Tris-base（Carl Roth GmbH，目录号：4855.2）
二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，目录号：1.02950）
胎牛血清金（PAA Laboratories GmbH，目录号：A15-151），-20℃
青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140-122），4℃
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030-024），4℃
MEM非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：11140-035），4℃
重组胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：91077C-1G），-20℃等分试样
氢化可的松21-半琥珀酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H4881），-20°C等分试样
培养基（见食谱）
10x PBS缓冲液（参见食谱）
5 mM Tris-HCl（见食谱）

设备

移液器（Gilson P1000，P200，P20; Eppendorf P2.5）
细胞计数器（Bio-Rad，TC20 TM 自动细胞计数器，目录号：1450102）
Thermomixer（Eppendorf，ThermoMixer C，目录号：5382000015）
微量离心机（Thermo Fisher Scientific，Heraeus TM Pico TM 21 Centrifuge，目录号：75002553）
热循环仪（Labrepco，Biometra T3000热循环仪48，目录号：050-723）
qPCR热循环仪（Bio-Rad，C1000 Touch TM 热循环仪，带96孔快速反应模块，目录号：1851196）

软件

CFX96实时系统
（Bio-Rad， http： //www.bio-rad.com/en-us/product/cfx96-touch-real-time-pcr-detection-system ）
CFX经理 TM 软件
（Bio-Rad， http：// www.bio-rad.com/en-us/sku/1845000-cfx-manager-software?ID=1845000 ）

程序

图1.该方案的工作流程图感染高模型（> 300）的易感细胞（PHH，HepaRG NTCP ，HepG2 NTCP ）裂解HBV。 A.裂解物在蛋白酶K存在下于70℃温育，然后加载到硅胶柱上并洗脱。 B.T5外切核酸酶（5单位/ 1小时）去除宿主基因组DNA（黑色）和HBV复制中间体（rcDNA，dslDNA，等。）（绿色）并保留完整的cccDNA（红色）。 C.通过p1040 / p1996扩增cccDNA，并通过探针p1085检测。

从体外感染的肝细胞中提取HBV DNA（图1A）
1. 对于在24孔板（培养区域：2 cm 2 ）中进行的感染，胰蛋白酶消化并重悬感染的PHH，分化的HepaRG NTCP 或HepG2 NTCP 细胞（感染程序见Ni和Urban，2017）在1ml培养基中。通过细胞计数器取10μl重悬浮液进行细胞计数（参见设备）。计算总细胞数。
  注意：
  1. 在汇合时，24孔板的一个孔中的细胞大致对应于180,000 PHH，200,000 HepaRG NTCP 和500,000 HepG2 NTCP 细胞。
  2. 当使用更小或更大的板时，应根据孔的相应培养面积（cm2）调整方案中给出的各缓冲液的体积。
2. 在室温下旋转细胞（900 x g ，5分钟）。用1ml PBS洗涤细胞两次。旋转细胞并小心吸出PBS（可选：冷冻细胞沉淀在-20°C下长期储存）。对于DNA提取，NucleoSpin Tissue试剂盒（740952.250）的制造商手册适用于对步骤A2中的孵育时间（1小时而不是10~15分钟）和步骤A6中的洗脱体积（50μl而不是100）的微小修改。微升）。加入200μl裂解缓冲液T1，上下吸移，在室温下孵育10分钟。加入25μl蛋白酶K和200μl裂解缓冲液B3，涡旋并在70°C振荡（500 rpm）孵育裂解液1小时。
  注意：蛋白酶K消化后，没有必要重新离心裂解液。立即执行下一步。
3. 向样品中加入210μl乙醇（96％-100％）并剧烈涡旋几秒钟。通过短暂离心从盖子中取出缓冲液并将样品应用于色谱柱。在室温下离心（11,000 x g ，1分钟）。丢弃流通。
4. 加入500μl洗涤缓冲液BW。在室温下离心（11,000 x g ，1分钟）。丢弃流通。
5. 向柱中加入600μl洗涤缓冲液B5（预先将指定体积的乙醇加入缓冲液B5浓缩物中）。在室温下离心（11,000 x g ，1分钟）。丢弃流通。重复此步骤一次。
6. 从柱中除去残留的乙醇（13,000 x g ，1分钟）。将柱子放入1.5ml微量离心管中。加入50μl预热（70°C）洗脱缓冲液。在室温下孵育1分钟。离心（11,000 x g ，1分钟）。在-20°C冷冻洗脱的DNA样品直至使用或立即分析。
  注意：
  1. 洗脱缓冲液是不含核酸酶的水或5mM Tris-HCl（pH = 8.0）。不要在下一步使用可能抑制酶活性的EDTA缓冲液。
  2. 洗脱液中的DNA浓度为200-1,000 ng /μl。
  3. 保留至少10μl未经T5核酸外切酶消化的样品，用于定量β-珠蛋白（内标）用于标准化使用。
T5核酸外切酶水解总DNA洗脱液（图1B）
1. 将反应组分装配在0.2ml微量离心管中，如下图所示：
  
  注意：不要超过T5核酸外切酶的单位和孵育时间，因为过度消化会导致cccDNA部分丢失。
2. 将反应在37°C孵育1小时，并在带有热盖供应的热循环仪中将酶在70°C下灭活20分钟。
3. 通过实时qPCR进行定量或将产物冷冻至-20℃直至使用。
通过实时qPCR定量cccDNA相对于人β-珠蛋白（单拷贝基因）（图1C）
1. cccDNA的定量分析
  1. 将引物和探针稀释至10μM：
    
    FAM：6-羧基荧光素; TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明
  2. 在96孔硬壳PCR板中准备以下qPCR反应：
    
    ＃进行绝对定量，每个1:10连续稀释的质粒加载2μl（pSHH2.1：10 9 ，10 8 ，10 7 ，10 6 ，10 5 ，10 4 ，10 3 ，10 2 拷贝/μl）作为同一平板上的模板。
  3. 运行下面的qPCR程序：
  4. 读取CFX Manager TM 软件中的绝对cccDNA拷贝数。计算每孔的cccDNA拷贝数。
2. 在T5核酸外切酶消化之前定量人β-珠蛋白
  1. 以10μM稀释引物：
  2. 在96孔板中制备qPCR反应：
  3. 启动以下qPCR程序：
  4. 读取人β-珠蛋白的水平。使用人β-珠蛋白的值使每孔的cccDNA拷贝标准化。计算每个细胞的cccDNA拷贝数（每孔拷贝数除以每孔的细胞数）。例如，如果24孔板孔中的细胞数为4.2×10 5 （如方法A1中所确定），则每孔的cccDNA拷贝数为8.52×10 5 （如方法C中所确定），每个细胞的cccDNA拷贝数是2.03。

数据分析

根据图2计算每个细胞或感染细胞的cccDNA拷贝数。体外感染细胞中的cccDNA水平可以类似于图3和Qu 等所示的两个实例来确定。请注意，为了区分来自接种物的信号，我们强烈建议使用进入抑制剂（例如，Myrcludex B）作为对照。常规Myrcludex B对照给出每个感染细胞低于0.05拷贝的值。

图2.绝对cccDNA拷贝数的计算示意图。＆nbsp; A 。在实验当天，确定孔中的细胞数。 B.按照程序中的建议提取总DNA样品。 C.这里显示了正确的T5核酸外切酶消化，如程序中所示。 D.分别如程序中所示定量绝对cccDNA拷贝和人β-珠蛋白的E水平。 “cccDNA拷贝/细胞”是“cccDNA拷贝/孔”除以“细胞数”。可选：F。如果需要计算每个感染细胞的拷贝数，则在感染期间必须在同一平板上平行排列另外的孔。在DNA提取当天，将孔中的细胞固定并进行免疫荧光测定（使用DAKO B0586抗体进行HBcAg可视化，等）以确定感染性（％：HBcAg阳性细胞数除以总细胞数）（Qu et al。，2018）。 “cccDNA拷贝/感染细胞”是“cccDNA拷贝/细胞”除以“感染性（％）”。

图3.三种体外中的cccDNA水平。模型和IFN-α-2a和Myrcludex B处理。 A.PHH，分化的HepaRG NTCP 和HepG2 NTCP 细胞用HBV感染m /细胞在感染期间，Myrcludex B（1μM）是阻断cccDNA形成的进入抑制剂，与HBV接种物共同施用。在感染后第7天，测定每个感染细胞的cccDNA拷贝。以三个独立实验收集以三角形显示的数据。 B.HPV2 NTCP 细胞用模拟处理（未处理）的mV /细胞500的HBV感染，在感染期间与Myrcludex B（1μM）共同处理，或共同和后处理购自PeproTech和PBL Assay Science的100ng / ml的IFN-α-2A。在感染后第7天，分析每个感染细胞的cccDNA拷贝。统计： P ＆lt;未处理0.01对IFN处理; P = 0.828 PeproTech与PBL。

笔记

引物对（pp1040-1996）对基因型D中形成的cccDNA具有特异性。基因型D是HepAD38细胞系中的HBV基因组。如果患者使用该方案尝试使用患者来源的血清进行体外感染，则应考虑此问题，因为患者中的HBV可以是任何基因型，并且pp1040-1996不结合其他基因型的形成的cccDNA。
其他基因型的Genbank登录号：A（HE974370.1）; B（AB540582.1）; C（AB540584.1）; E（HE974384.1）; F（HE974369.1）; G（AP007264.1）; H（AB846650.1）。 pp1578-1867和pp1583-2301（Qu et al。，2018）允许定量八种HBV基因型（A-H），如下所述。（表格1）

表1. HBV基因型的引物错配列表。下面总结了每种正向和反向引物与8种HBV基因型的碱基对错配数。绿色方块：完美装订;黄色方块：一个碱基对错配仍然允许模板结合;红色方块：没有约束力。

F：正向引物; R：反向引物。＃：该协议的探针不是泛基因型，并且具有错配数，如下所示：A（1），B（2），C（0），D（0），E（0），F（6），G （1），H（4）。

食谱

文化媒体
对于HepG2 NTCP 细胞：补充有10％胎牛血清（热灭活），100U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺，1％MEM非必需的DMEM氨基酸。感染时，加入2％二甲基亚砜
对于PHH和HepaRG NTCP 细胞：William's培养基E补充10％胎牛血清（热灭活），100 U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素，2 mM L-谷氨酰胺，1％ MEM非必需氨基酸，5μg/ ml重组胰岛素，50μM氢化可的松。为了分化和感染，加入1.5％二甲基亚砜
10x PBS
溶解80克NaCl，2克KCl，11.5克Na 2 HPO 4 •2H 2 O和2克KH 2 PO 4 ，将pH调节至7.4，再填充H 2 O至1L
Tris-HCl（1M）
将121.14克Tris碱溶于800毫升H 2 O中，调节pH至8.0，再填充H 2 O至1L

致谢

该协议改编自Qu et al。，2018。我们在此承认Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG，德国研究基金会） - 项目编号272983813-SFB / TRR179（BQ和SU）和德国中心的财政支持感染研究（DZIF）TTU肝炎项目05.704（SU）。我们感谢Pascal Mutz（DKFZ，德国）和Florian WR Vondran（德国MHH）提供PHH。我们感谢薛莉对这份手稿的批判性阅读。

利益争夺

相应作者Stephan Urban教授拥有Myrcludex B的专利和知识产权。

伦理

根据患者的书面知情同意，从部分肝切除术后获得的肝脏标本中分离出PHH。

参考

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