材料和试剂

200μl和1,000μl移液器吸头
1.5毫升管（Eppendorf，目录号：022363204）
15毫升灭菌管（VWR，目录号：89039-664）
50毫升灭菌管（VWR，目录号：89039-656）
用于细菌接种的1 ml无针注射器（BD，目录号：309659）
Kimwipes（金佰利 - 克拉克，目录号：34120）
Pseudomonas syringae pv。表达AvrRpt2效应子的番茄 DC3000（ Pst AvrRpt2 ）
卫生署<子> 2 0
MgCl 2 （Sigma，目录号：M8266）或MgSO 4 （Sigma，目录号：M7506）
甘露醇（西格玛，目录号：M4125）
Agar A（Bio Basic，目录号：FB0010）
蛋白胨（BD Biosciences，目录号：211684）
K 2 HPO 4 ·3H 2 O（Fisher scientific，CAS：16788-57-1）
1 M MgSO 4 （VWR，目录号：0338-500G）
80％甘油（西格玛，目录号：G5516）
King's B琼脂（参见食谱）板用卡那霉素（50μg/ ml）和利福平（25μg/ ml）抗生素选择
400毫升甘露醇溶液（见食谱）

设备

1升烧杯
振荡器（Lab Companion，SI-600R）
水浴（Precision Scientific，Model 25）
生长室（Percival，AR36L3）
移液管（Eppendorf，20-200μl和100-1,000μl）
分光光度计（Amersham Biosciences，型号：Ultraspec 2100 pro）
电导率仪（Thermo Scientific，型号：Orion Star A322）
打孔器和取样工具（Electron Microscopy Sciences，型号：EMS Rapid-core 6.0，目录号：69039-60）

软件

Microsoft Excel
图形棱镜，或R

程序

在22℃，50％RH 12小时光照/ 12小时黑暗条件下，在土壤上每种基因型生长12株植物3周。
在15 ml管中，在10 mM MgCl 2 （或MgSO 4 中制备 Pst AvrRpt2 （OD 600nm = 0.002）子>）。
使用1毫升无针注射器，压力渗透3个完全展开的叶子（叶子4,5和6）
每株植物含有 Pst AvrRpt2 。
注意：从叶背面渗透更容易。
使用Kimwipes轻轻地干燥过量的 Pst AvrRpt2 接种物。＆nbsp;
将植物移至设定为比较条件的室。在50％RH 22°C 12 h光照/ 12 h黑暗下保持每种基因型6株植物，其他6种植物每种基因型90％RH 22°C 12 h光照/ 12 h黑暗条件持续36 h。
注意：我们在OD 600nm = 0.002时使用 Pst AvrRpt2 来捕捉环境对正在发展的ETI的影响。在这种接种物中，在50％RH的植物中，大约24 hpi的眼睛可以看到过敏反应。
在1L烧杯中收集dH 2 O并确认电导率低于1.5μS/ cm。
注意：高dH 2 O电导率会产生很高的噪音，并可能导致实验失败。
使用EMS Rapid-core 6.0打孔机，在50ml管中收集每株植物3叶盘（每叶1个盘）（即，每个基因型6个管）。
如果有兴趣以百分比形式报告数据，请单独标记每个管（参见步骤15）
向每个管中加入30ml dH 2 O并通过倒置管3次冲洗圆盘。
使用dH 2 O，每种基因型制备100ml 400mM甘露醇（7.3g甘露醇，100ml dH 2 O）。
注意：确认400 mM甘露醇的离子测量值不大于3μS/ cm。
对于每个含有叶盘的管，用6ml 400mM甘露醇替换所有dH 2 O.
通过在空的50ml管中加入6ml 400mM甘露醇进行空白，以便在数据分析期间进行测量校正
在室温下以100rpm摇动管2小时。
使用Thermo Scientific Orion Star A322电导率仪测量初始离子泄漏（见图1）并进行数据分析。
注意：测量时，注意不要在测量过程中伤害叶片或将光盘移过管道。
（可选步骤）如果以离子泄漏百分比的形式显示数据。
1. 在10分钟内，通过将管移至设定在100℃的水浴中来煮沸样品。
2. 冷却管到RT。
3. 测量总离子泄漏并进行数据分析。
图1.使用Thermo Scientific Orion Star A322电导率仪描述离子泄漏测量的图片

数据分析

将校正电导率值或校正初始电阻与校正总电导率的百分比表示为现有数据（见图2）。
校正电导率=测量电导率 - 空白电导率。
百分比= 100×（初始校正电导率/总校正电导率）

图2.高湿度抑制过敏反应。 A.电导率值
测量36 hpi和煮沸后。在用 Pst AvrRpt2 OD 600nm = 0.002接种后，将植物移至50％RH或90％RH。 B和C.将（A）中描述的过敏反应的定量作为膜离子泄漏测量（B）和膜离子泄漏百分比（C）绘制成图。数据是平均值±S.D.
至少重复三次实验，以获得数据重现性。＆nbsp;
对于统计分析，使用双向ANOVA。可以使用线性混合效应模型组合三个实验重复。

食谱

King's B琼脂（1升）
15克琼脂A
20克蛋白胨
2g K 2 HPO 4 。 3H 2 O
在120℃高压灭菌20分钟，然后加入6.1ml高压灭菌的1M MgSO 4 ，18.8ml高压灭菌的80％甘油＆nbsp;
400mM甘露醇溶液（1L）
将72.88g甘露醇加入500ml dH 2 O
搅拌溶解甘露醇
添加dH 2 O使体积达到1 L

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（1R01-GM099839-01,2R01-GM069594-09和5R35-GM118036）以及霍华德休斯医学研究所和戈登和贝蒂摩尔基金会（GBMF3032）的资助。我们已经从Woo et al。（2001）改编了这个协议。

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益。

参考

Francl，L。J.（2001）。疾病triangel：重新审视植物病理范例。植物健康教练。 Doi：10.1094 / PHI-T-2001-0517-01。
Hatsugai，N。和Katagiri，F。（2018）。通过电解质渗漏检测定量植物细胞死亡。生物协议 8（5 ）：e2758。＆nbsp;
Mwimba，M.，Karapetyan，S.，Liu，L.，Marques，J.，McGinnis，E.M.，Buchler，N.E。和Dong，X。（2018）。每日湿度振荡调节生物钟以影响植物生理学。 Nat Commun 9（1）：4290。
Scholthof，K。B.（2007）。疾病三角：病原体，环境和社会。 Nat Rev Microbiol 5（2）：152-156。
Woo，H.R.，Chung，K.M.，Park，J.H.，Oh，S.A.，Ahn，T.，Hong，S.H.，Jang，S.K.and Nam，H.G。（2001）。 ORE9，一种调节拟南芥叶片衰老的F-box蛋白质。植物细胞 13（8）：1779-1790。
Xin，X.F.，Nomura，K.，Aung，K.，Velasquez，A.C.，Yao，J.，Boutrot，F.，Chang，J.H.，Zipfel，C.and He，S.Y。（2016）。细菌在对毒力至关重要的植物中建立水生生物空间。自然 539（7630）：524-529。
Zhou，F.，Menke，F.L。，Yoshioka，K.，Moder，W.，Shirano，Y。和Klessig，D.F。（2004）。高湿度抑制ssi4介导的细胞死亡和MAP激酶活化，H2O2产生和防御上游的疾病抵抗基因表达。 Plant J 39（6）：920-932。