材料和试剂

移液器吸头（Tarsons）
Spatula（Fisher Scientific，目录号：11533462）
滤纸（Whatman过滤器，第1号）
15毫升和50毫升离心管（塔森）
透析膜（Thermo Fisher Scientific，截留分子量10 kDa（MWCO）;目录号：68100）
Econo-column玻璃色谱柱（Bio-Rad，目录号：7371512）
0。苜蓿 var。 Pusa Basmati-1（PB-1）
注意：PB-1是一种芳香品种的驯化米。
液氮
Concanavalin-A beads（Sigma-Aldrich，目录号：C7555-5ML）
氯化钠（NaCl）（HiMedia，目录号：MB023-1Kg）
氯化镁（MgCl 2 ）（Fischer Scientific，目录号：15535-500G）
氯化锰（II）（MnCl 2 ）（Sigma，目录号：M8054）
氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma，目录号：C3306-250G）
Tris-base（Fisher Scientific，目录号：15965-500G）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：29505）
Tris-HCl（pH 6.8和8.8）（Bio-Rad）
醋酸钠（CH 3 COONa）（HiMedia，目录号：MB048-500G）
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（Sigma，目录号：P5288-100G）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma，目录号：P7626-5G）
二硫苏糖醇（DTT）（罗氏，目录号：11096176001）
甘氨酸（Sigma，目录号：G7126-100G）
蛋白质鸡尾酒抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：5056489001）
4-羟基吲哚（Sigma-Aldrich，目录号：219878）
甘露糖（Sigma-Aldrich，目录号：112585）
蛋白质浓缩器（Sartorius，Vivaspin，30,000 d MWCO，目录号：VS15T21）
30％丙烯酰胺（Bio-Rad，目录号：161-0156）
10％十二烷基硫酸钠（SDS）（Invitrogen，目录号：15525-017）
10％过硫酸铵（Sigma，目录号：161-0700）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma，目录号：T7024-25ml）
考马斯亮蓝（CBB-R-250）（Sigma，目录号：B-7920-10G）
溴酚蓝（Sigma，目录号：B5525-5G）
甘油（Millipore，目录号：DC4P640148）
乙醇（Emsure，目录号：1.00983.0511）
乙酸（Fisher Scientific，目录号：11005）
甲醇（默克，目录号：60600905001730）
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：13825）
透析缓冲液（见食谱）
提取缓冲液（见食谱）
平衡缓冲液（见食谱）
洗涤缓冲液（见食谱）
再生缓冲液（见食谱）
存储缓冲区（参见食谱）
50 mM甘露糖（见食谱）
12％SDS-PAGE凝胶（见食谱）
TGS缓冲区（见食谱）
Native-PAGE凝胶（见食谱）
天然凝胶样品上样染料（6x）（见食谱）
TG缓冲液（见食谱）
CBB-R-250染色液（见食谱）
Destaining解决方案（见食谱）
5 mM 4-羟基吲哚（见食谱）

设备

剪刀
抹刀
锥形瓶
砂浆和杵（Sigma，目录号：Z247472和Z247510）
移液器（Gilson，型号：P1000，P200，P100，P20和P10）
冷离心机（Thermo Scientific，Heraeus Megafuge 16R，75003694）
-20°C冰箱（Panasonic）
Thermomixer（Eppendorf，Thermomixer comfort）
化学通风橱
摇臂＆NBSP;
电磁搅拌机
磁珠
蠕动泵（Cole Parmer 7520-67 Masterflex控制台驱动器，型号：77200-52）

注意：未在公司和产品目录中提供的材料，试剂和设备可以从任何合格的公司订购，以便在本实验中使用。

程序

从水稻茎中提取总蛋白
1. 用液氮冷却研钵和研杵，并将30g新鲜或-80℃冷冻干燥样品分成4份，每份7.5g，以方便并在液氮中冷冻。取出每份样品，用预先冷却的剪刀在预先冷却的砂浆中将组织切成约1-2cm长的小块。
2. 使用研钵和研杵使用液氮将组织研磨成细粉。在冰冷的刮刀的帮助下将粉末收集在50ml离心管中，并将其置于液氮中。对剩余的样品重复相同的操作。
3. 向每个离心管中加入45ml提取缓冲液并倒置管以均化。将离心管放在4°C的摇臂上1小时，设定速度为每分钟50次摇摆。＆nbsp;
4. 在7,177 x g ，4℃下离心45分钟。
5. 通过Whatman滤纸将上清液过滤至新鲜的高压灭菌的锥形瓶中。
6. 将滤液转移到10cm长的透析袋中，并在4L透析缓冲液中在4℃下在搅拌器上以120rpm透析过夜。
7. 收集透析的蛋白质样品并用于漆酶的纯化。
从粗蛋白质提取物中纯化漆酶
1. 使用1毫升切割的移液管尖端，用伴刀豆球蛋白A珠缓慢加载经济柱。允许它在柱子底部沉降。分离柱长度为1.5cm×2.5cm（直径×长度）。
2. 用4柱体积（CV）的洗涤缓冲液洗涤柱子。使用蠕动泵在整个过程中保持1ml / min的流速。
3. 用4 CV的平衡缓冲液预平衡柱子。
4. 将总粗蛋白质样品缓慢地通过柱壁，不使用1ml移液管干扰。
5. 用3 CV的洗涤缓冲液洗涤柱子以洗涤未结合的蛋白质。
6. 洗脱漆含9ml 50mM甘露糖，三次洗脱，每次3ml。
7. 用纯化的漆酶装载蛋白质浓缩器并在7,177 x g ，4℃下离心以将洗脱的蛋白质浓缩至最多200μl。
8. 用3 CV的平衡缓冲液洗涤柱子，然后用Milli-Q过滤的水洗涤。
9. 通过将再生缓冲液A和B交替传递4次来重新生成色谱柱。
10. 将1 CV的储存缓冲液通过色谱柱，并将珠子储存在4°C的储存缓冲液中。
11. 获得的纯化漆酶可用于凝胶内染色（Swetha等，等，2018）。使用来自天然凝胶的约50-65kDa的切割显着条带进行标准质谱（LC-MS）以确认漆酶的存在并排除过氧化物酶的污染（因为植物过氧化物酶的范围为40-50kDa）。
12. 将浓缩的蛋白质以约30μl加载到12％SDS凝胶上，并在TGS缓冲液中在80V下电泳2小时。
13. 用CBB将凝胶染色过夜，然后在室温下在脱色溶液中脱色4小时。
纯化漆酶的凝胶内染色
1. 通过将8μl天然凝胶样品上样染料（6x）添加至约30μl的浓缩蛋白质来进行样品制备。
2. 将蛋白质样品加载到12％天然凝胶上，并在80℃和4℃下在TG缓冲液中电泳2小时。
3. 用水洗涤凝胶3至4次，然后用30ml 5mM 4-羟基吲哚染色凝胶2小时。

数据分析

数据分析可以参考图3和4，以及来自Swetha 等人的补充图S7和S8，，2018。

笔记

蛋白质提取和纯化所需的所有缓冲液应在使用前预先冷却至4°C。
在制备提取缓冲液时，首先加入Tris和盐，将缓冲液冷却至4°C，然后调节pH值。最后将PMSF和蛋白质混合抑制剂加入冷却的缓冲液中。
要重新生成伴刀豆球柱，通过再生缓冲液A和B，或者从缓冲液A开始，也以缓冲液A结束。
必须使用质谱（LC-MS）来确认纯化后漆酶的存在。

食谱

透析缓冲液（3升）
100mM CH 3 COONa（40.8g）
将Milli-Q过滤水加入2.5L的体积中冷却至4°C，然后用冰醋酸将pH调节至4.5 将体积混合并补足至3L，并在4°C下储存
提取缓冲液（500毫升）
50mM Tris（3.025g）
1 M NaCl（30 g）
1.5M CaCl 2 （110.25g）
将Milli-Q过滤水加入400 ml的体积中冷却至4°C，然后用1N HCl将pH调节至8 150毫克DTT
0.1％（w / v）PVP（0.5g）
0.5M PMSF（87mg）（首先溶于1.5ml乙醇中，然后加入缓冲液中）
1片蛋白质鸡尾酒抑制剂
混合并补足体积至500毫升，储存在4°C
注意：每次都应该为这个缓冲区做好新的准备。
平衡缓冲液（750毫升）
50 mM Tris（4.533g）
将Milli-Q过滤水加入650 ml的体积中冷却至4°C，然后用1N HCl将pH调节至7.5
0.5 M NaCl（22.5 g）
1mM MgCl 2 （152.25mg）
1mM CaCl 2 （110.25mg）
1mM MnCl 2 （148.44mg）
混合并补足体积至750毫升，储存在4°C
洗涤缓冲液（500毫升）
1 M NaCl（29.22 g）
5mM MgCl 2 （238mg）
5mM CaCl 2 （367.5mg）
5mM MnCl 2 （491.6mg）
加入Milli-Q过滤水至500 ml的体积并储存在4°C
再生缓冲液（每500毫升）
1. 再生缓冲液A
  0.1M Tris（6.057g）
  将Milli-Q过滤水加入400 ml的体积中冷却至4°C，然后用1N HCl将pH调节至8.5
  0.5 M NaCl（15 g）
  混合并补足体积至500毫升，并在4°C下储存
2. 再生缓冲液B
  0.1M CH 3 COONa（6.8g）
  将Milli-Q过滤水加入400 ml的体积中冷却至4°C，然后用冰醋酸将pH调节至4.5 1 M NaCl（29.21 g）
  混合并补足体积至500毫升，并在4°C下储存
储存缓冲液（40毫升）
0.1 M CH 3 COONa（544 mg）
0.1 M NaCl（2.33 g）
1mM CaCl 2 （5.88mg）
加入Milli-Q过滤水至30 ml的体积 20％乙醇（8毫升）
混合并补足体积至40毫升，储存在4°C
50 mM甘露糖（20 ml）
在20ml平衡缓冲液中加入180mg甘露糖
12％SDS-PAGE凝胶
1. 分离凝胶缓冲液（8毫升）
  3.2毫升30％丙烯酰胺
  2.64毫升Milli-Q过滤水
  2ml 1.5mM Tris-HCl（Bio-Rad）（pH8.8）
  0.08毫升10％SDS
  0.08毫升10％过硫酸铵
  0.008毫升TEMED
  注意：将堆积凝胶倒入铸件后，在顶部加入500μl异丙醇。
2. 堆积凝胶缓冲液（5毫升）
  0.83毫升30％丙烯酰胺
  3.44毫升Milli-Q过滤水
  0.63ml 1.5mM Tris-HCl（Bio-Rad）（pH6.8）
  0.05毫升10％SDS
  0.05毫升10％过硫酸铵
  0.005毫升TEMED
  注意：在倒入堆积凝胶之前，取出异丙醇，用水冲洗并插入Whatman纸片干燥。
TGS缓冲液（1.5升，1倍工作）
25mM Tris（4.5g）
192 mM甘氨酸（21 g）
0.1％SDS（1.5克）
加入Milli-Q过滤水，混合并补足至40 ml的体积。在室温下储存。
Native-PAGE凝胶
1. 分离凝胶缓冲液（10毫升）
  4毫升30％丙烯酰胺
  3.3毫升Milli-Q过滤水
  2.5ml 1.5mM Tris-HCl（Bio-Rad），pH8.8
  0.1毫升10％过硫酸铵
  0.01毫升TEMED
  注意：将堆积凝胶倒入铸件后，在顶部加入500μl异丙醇。
2. 堆积凝胶缓冲液（5毫升）
  0.83毫升30％丙烯酰胺
  3.44毫升Milli-Q过滤水
  0.63ml 1.5mM Tris-HCl（Bio-Rad），pH 6.8
  0.05毫升10％过硫酸铵
  0.005毫升TEMED
  注意：在倒入堆积凝胶之前，取出异丙醇，用水冲洗并彻底去除水分。在加载样品之前，将凝胶在4°C下预运行30分钟。
天然凝胶样品上样染料（6x）
187.5mM Tris-HCl，pH 6.8，含25％甘油和1％溴酚蓝
TG缓冲液（pH 8.3,1.5 L，1x工作）
25mM Tris（4.5g）
192 mM甘氨酸（21 g）
加入Milli-Q过滤水，混合并补足至1,500 ml的体积，并在4°C下储存。
CBB-R染色溶液（100毫升）
0.25克CBB R-250
45毫升甲醇
45毫升双蒸馏（dd）H 2 O
10毫升乙酸
Destaining解决方案
乙醇：乙酸：ddH 2 O = 1：1：2
5mM 4-羟基吲哚
首先，将133.2mg 4-羟基吲哚溶于2ml乙醇（500mM 4-羟基吲哚）中。然后在30 ml Milli-Q过滤水中加入300μl500mM稀释至5 mM 4-羟基吲哚。

致谢

该协议是通过修改Jaiswal et al 的方法开发的。（2015年）。感谢K. Veluthambi教授的水稻种子。作者感谢Ramanujan奖学金（SR / S2 / RJN-109/2012;印度政府科学技术部）对PVS的财政支持。 PVS实验室得到了NCBS-TIFR核心资金和印度政府生物技术部的资助（BT / PR12394 / AGIII / 103/891 / 2014）的支持。 SC承认印度DBT的奖学金。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

Jaiswal，N.，Pandey，V。P.和Dwivedi，U。N.（2015）。使用亲和力从番木瓜（ Carica papaya ）中纯化耐热碱性漆酶色谱法。 Int J Biol Macromol 72：326-332。
Swetha，C.，Basu，D.，Pachamuthu，K.，Tirumalai，V.，Nair，A.，Prasad，M。和Shivaprasad，P.V。（2018）。籼稻中与驯化相关的主要表型是由于miRNA介导的漆酶沉默丧失所致。植物细胞 30（11）：2649-2662。