材料和试剂

幻灯片Menzel-GläserSuperfrost® PLUS 25 x 75 x 1.0 mm（Thermo Fisher Scientific，目录号：J1800AMNZ）
盖玻片（Knittel Glass，24 x 50 mm，目录号：023/40）
PAP笔（DakoPen，Dako，目录号：S2002）或同等产品
Tissue Tek容器/染色盘绿色（耐溶剂）（Sakura，目录号：SKU4456）
纸巾
铝箔
0.2μm注射器过滤器（VWR，目录号：514-0060）
一抗
1. 兔抗Wilms肿瘤蛋白（WT-1）（稀释比例1：100，加入1μl抗体和99μl封闭溶液）（克隆[CAN-R9（IHC）-56-2]）（Abcam，目录号：ab89901）＆nbsp;
2. 生物素化的山羊抗小鼠podocalyxin（稀释比1：500，放入1μl抗体和499μl封闭溶液）（R＆amp; D，目录号：BAF1556）
二抗
1. Alexa Fluor 594驴抗兔（稀释比例1：400，加入1μl抗体和399μl封闭液）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A21207）＆nbsp;
2. Alexa Fluor 488驴抗山羊（稀释比例1：400，放入1μl抗体和399μl封闭溶液）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A11055）
3. 链霉抗生物素蛋白，Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，目录号：S32354）
二甲苯（Carlo Erba，目录号：528251）
绝对乙醇（Carlo Erba，目录号：3086072）
目标检索解决方案（Dako，目录号：S1699）
荧光安装介质（Dako，目录号：S3023）
DAPI溶液（1 mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：62248）
清除指甲油（可在当地药店购买）
磷酸盐缓冲盐水10x（Euromedex，目录号：ET330）
Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
Tween ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇，目录号：A2058）
苏丹黑B（Acros organics，目录号：190160250）
Tris（Euromedex，目录号：200923-A）
NaCl（Euromedex，目录号：1112-A）
Tris缓冲盐水（TBS）（见食谱）
TBS-Tween（1x）（见食谱）
渗透解决方案（见食谱）
阻止解决方案（见食谱）
Sundan Black B解决方案（见食谱）

设备

Axioimager Z1 apoptome（蔡司）
压力锅，可以使用任何压力锅，这里Decloaking室（Biocare医疗，型号：DC2008）
台式轨道振动筛（Stuart科学陀螺摇杆，型号：STR9）
4°C冰箱

软件

Axiovision显微镜软件（版本AxioVs40 V 4.8.2.0，Zeiss）

程序

准备二甲苯（2个容器），乙醇（100％，95％，70％）和蒸馏水浴，在染色皿中加入300毫升溶液。
注意：染色在新鲜切割的组织中效果很好。
Deparaffinate Formalin固定石蜡包埋（FFPE）小鼠肾脏。将部分放入：
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：160px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>二甲苯
5分钟
二甲苯
5分钟
注意：在进入乙醇步骤之前，请确保完全去除部分。如果仍有痕量的蜡浸泡在二甲苯中5分钟。

class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：160px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>乙醇100％
3分钟
乙醇95％
3分钟
乙醇70％
3分钟
蒸馏水
根据制造商的说明准备300毫升新鲜抗原修复溶液。＆nbsp;
打开高压锅的电源按钮。按“显示设置”按钮设置温度和时间，直到SP1 LED指示灯亮起。使用向上或向下箭头将温度调节到所需的检索温度（95°C）。按“显示设置”按钮一次，将显示SP1时间。使用向上和向下箭头调整到适当的时间。＆nbsp;
将载玻片浸入染色容器（约300ml）的Tissue Tek架中的抗原修复溶液中。将组织Tek容器放置在偏离中心的隔热罩顶部以避免热量集中。不得覆盖容器。破碎室最多可容纳4个机架，每个机架包含24个滑块。
注意：请勿使用玻璃容器。
1. 对齐外壳和平底锅手柄。＆nbsp;
2. 将盖子蚀刻“OPEN”与平底锅手柄上的白点相匹配。＆nbsp;
3. 用左手握住外壳和平底锅手柄，同时用右手顺时针转动盖子，直到盖子上的“CLOSED”蚀刻与左侧平底锅手柄的白点对齐。＆nbsp;
4. 盖子上的金属片应紧贴锅的唇部。＆nbsp;
5. 将控制面板右侧的红色拨动开关转到“ON”位置，打开仪器。＆nbsp;
6. 按“DISPLAY SET”一次，直到SP1 LED亮起。＆nbsp;
7. 用户可以多次按“DISPLAY SET”按钮来滚动仪器设置。＆nbsp;
8. 按“开始/停止”按钮开始编程运行。＆nbsp;
9. 程序完成后，目视确认压力表上的压力已降至0（零）psi。＆nbsp;
10. 切换重量（petcock）以释放任何残余压力。关闭本机。＆nbsp;
11. 打开盖子，蒸汽远离自己。＆nbsp;
12. 将容器放在Decloaking Chamber中冷却10分钟。
小心地从高压锅中取出Tissue Tek容器，并将其置于室温（RT）下20分钟以冷却。最终温度应为室温（RT）。
从Tissue Tek容器中取出载玻片，用PAP笔（液体阻滞剂）将载玻片上的肾切片包围。
注意：不要让组织干燥。
准备透化溶液，将其轻轻地放在限定区域内，将其加到载玻片上，确保组织完全被覆盖，并在室温下孵育载玻片15分钟。
在绿色染色皿（具有约300ml缓冲液）的载玻片架中，在1x TBS-Tween中洗涤载玻片3次，每次5分钟，确保将组织浸入缓冲液中。每次清洗时，将载玻片容器放在台式轨道振动器上（75到100 rpm）。＆nbsp;
准备封闭溶液，添加载玻片并在室温下孵育载玻片60分钟。
在封闭溶液中制备抗WT1和抗podocalyxin一抗（用封闭缓冲液以1：100稀释WT-1,1：500：podocalyxin）。
将封闭溶液从载玻片上倾倒到纸巾上，然后将载玻片直接与一抗一起在4°C的加湿室中孵育过夜，从而丢弃封闭溶液。
注意：对于加湿室的组装，您需要：带盖的塑料盒，塑料移液管，纸巾和蒸馏水。用蒸馏水彻底润湿纸张并放入盒子中。将两个塑料移液器放在纸上，为载玻片创建支撑。将抗体溶液放在载玻片上，盖上盖子，孵育所需的时间。
孵育过夜后，在绿色染色皿（具有约300ml缓冲液）中的1x TBS-Tween中洗涤载玻片3次，每次5分钟。
准备第二抗体（一部分约50μl，用封闭溶液以1：400稀释）并直接加到载玻片上。在室温下将载玻片在铝箔包裹的加湿室中孵育60分钟，以确保避光。
注意：抗podocalyxin是一种生物素化抗体，因此可以使用荧光链霉抗生物素蛋白作为二抗（链霉抗生物素蛋白，Alexa Fluor 488）。
为了可视化DNA /细胞核，在1x PBS中制备DAPI溶液（1μg/ ml）（一节约50μl）。＆nbsp;
丢弃二抗溶液，在室温下直接在载玻片上涂DAPI溶液5分钟。＆nbsp;
然后，在室温下在绿色染色皿（具有约300ml缓冲液）中的1x TBS-Tween中洗涤载玻片3次，每次10分钟。
在室温下，在黑暗中将过滤的苏丹黑B溶液直接在载玻片上孵育30秒。
在流动的自来水下在绿色染色皿中洗涤载玻片10分钟。
加入少量荧光固定介质（1滴）并在样品上盖上盖玻片，避免产生气泡。＆nbsp;
使用透明指甲油将盖玻片的侧面密封到载玻片上。＆nbsp;
将载玻片在4℃下在黑暗中孵育过夜。＆nbsp;
成像后，载玻片可在4°C黑暗中保存至少6个月，荧光损失最小。

数据分析

对于用该方案获得的免疫荧光图片的实例，参见图1和2.

图1.仅使用二抗的阴性对照。图片显示二抗不会引起任何背景。比例尺：50μm。

图2.肾小球的免疫荧光图像，其中足细胞具有标记物的可视化。 WT-1（红色）和足糖萼蛋白（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。 A.来自雄性小鼠的正常肾（C57B1 / 6J，12周）。 B.来自患有高血压的小鼠的肾（男性，C57Bl / 6J）。这些图片显示WT1和足糖萼蛋白染色减少，表明足细胞和扩张的毛细血管损失。比例尺：50μm。

食谱

Tris缓冲盐水（TBS）
25 mM Tris
0.15 M NaCl
溶液的最终pH应为7.2至7.5
TBS-Tween（1x）
TBS含有0.1％吐温® 20
透化缓冲区
TBS含有0.1％Triton TM X-100
阻止解决方案
含有5％BSA的TBS-Tween 1x
苏丹黑B解决方案
0.1％苏丹黑B
70％乙醇
注意：苏丹黑B溶液在黑暗中补充，需要过滤（0.2μm注射器过滤器）以去除未溶解的染料。

致谢

我们感谢Tharaux实验室的成员，以及PARCC的组织学核心设施，以获得有益的信息。这项工作得到了欧洲研究委员会的Inserm的支持 - ERC Grant 107037 to P-L.T。和Néphrotique协会。我们感谢法国国家研究机构（ANR授予P-L.T。的“SWITCHES”）支持C. Henique。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

Henique，C.，Bollee，G.，Loyer，X.，Grahammer，F.，Dhaun，N.，Camus，M.，Vernerey，J.，Guyonnet，L.，Gaillard，F.，Lazareth，H.， Meyer，C.，Bensaada，I.，Legres，L.，Satoh，T.，Akira，S.，Bruneval，P.，Dimmeler，S.，Tedgui，A.，Karras，A.，Thervet，E。， Nochy，D.，Huber，TB，Mesnard，L.，Lenoir，O。和Tharaux，PL（2017）。 microRNA-92a的遗传和药理学抑制可维持足细胞周期静止并限制新月体性肾小球肾炎。 Nat Commun 8（1）：1829。
Moeller，M.J.，Soofi，A.，Hartmann，I.，Le Hir，M.，Wiggins，R.，Kriz，W。和Holzman，L.B。（2004）。足细胞在炎症性肾小球肾炎小鼠模型中填充细胞新月体。 J Am Soc Nephrol 15（1）：61-67。
Pavenstadt，H.，Kriz，W。和Kretzler，M。（2003）。肾小球足细胞的细胞生物学。 Physiol Rev 83 （1）：253-307。