材料和试剂

移液器吸头（Eppendorf，epT.I.P.S。）
6孔板（Thermo Fisher Scientific，BioLite 6-well Multidish，目录号：130184）
96孔U型或V型底细胞培养板（Corning，目录号：6902D09或6928A17）
5毫升圆底聚苯乙烯FACS管（Falcon，目录号：38007）
L-叠氮基高丙氨酸（AHA）（Anaspec，目录号：AS-63669，在去离子水中的500 mM储备溶液，保持在-20°C至少几个月）
不含甲硫氨酸的培养基，如Dulbecco's Modified Eagle's中高葡萄糖含4,500 mg / L葡萄糖和碳酸氢钠，不含L-蛋氨酸，L-胱氨酸和L-谷氨酰胺，液体，无菌过滤，适合细胞培养（Merk，目录编号：D0422）
胎牛血清，来自南美洲，透析，无菌过滤（Pan Biotech，目录号：P30-2102）
L-蛋氨酸（默克，目录号：M9625，在去离子水中制备300 mM储备液，保持在-20°C至少几个月）
L-胱氨酸二盐酸盐（Merck，目录号：C2526，在去离子水中制备新鲜的200mM（1,000x用于DMEM）溶液）
GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，目录号：35050061,200 mM储备液）
D-PBS（1x），无氯化钙，无氯化镁，无菌过滤（Thermo Scientific Fisher，目录号：14190144）＆nbsp;
Alexa Fluor488炔烃（赛默飞世尔科技，目录号：A10267）
磷酸组蛋白H3（Ser10）（D2C8）XP Rabbit mAb（Alexa Fluor 647 Conjugate）（Cell Signaling Technology，目录号：3458S）＆nbsp;
（+） - L-抗坏血酸钠（默克，目录号：A7631）＆nbsp;
铜（II） - 硫酸盐（CuSO 4 ）（Baseclick，目录号：BCMI-004-50）＆nbsp;
多聚甲醛（PFA）（Roth，335）
皂甙（西格玛奥德里奇，目录号：47036）
（可选）Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）＆nbsp;
牛血清白蛋白（BSA）（Roth，8076）
DMSO（默克，目录号：D8418）
EDTA（默克，目录号：EDS）
NaN 3 （默克，目录号：71289）
环己酰亚胺（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-3508）
用于AHA标记的细胞培养基（不含蛋氨酸或AHA）（参见食谱）
洗涤液（见食谱）
修复解决方案（参见食谱）
渗透解决方案（见食谱）
FACS缓冲液（见食谱）

设备

（可选）多通道移液器（Eppendorf，目录号：3122 000.043 [10-100μl]）
CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：51026331）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5418 R [管的固定角度]，5804 R [96孔板的摆动]）
流式细胞仪（FACS Aria仪器）（BD Biosciences）

软件

分析软件：FlowJo

程序

AHA脉冲标记
1. 在含有正常细胞培养基的6孔板中培养细胞，使细胞第二天达到50％-60％汇合。在该研究中使用小鼠B细胞（悬浮液），但可以使用任何细胞类型。
2. 第二天，在不含蛋氨酸的培养基中饥饿细胞30分钟。
  注意：可省略此步骤以避免细胞压力。
3. 通过向不含蛋氨酸的培养基中加入1mM AHA或甲硫氨酸（阴性对照）开始脉冲标记，并在37℃CO 2 培养箱中孵育细胞至少10分钟。环己酰亚胺处理（100μg/ ml）也可用作阴性对照。
4. 用冰冷的PBS洗涤细胞。将细胞在500 x g ，4℃下离心3分钟并除去上清液。再一次重复此步骤。对于粘附细胞如HEK293，PBS中的1mM EDTA可用于收获细胞。
  注意：从这一步开始，我们使用96孔U型或V型底细胞培养板进行后续步骤以提高通量。对于后续步骤，使用100-200μl溶液在纺丝后悬浮细胞。
5. 将细胞固定在固定溶液（PBS中的4％PFA）中，在室温下保持15分钟。旋转细胞并除去上清液。
6. 用含有0.2％皂苷（或0.25％Triton X-100）的1％BSA在PBS中渗透细胞15分钟。将细胞在500 x g 下旋转，在室温下旋转3分钟并除去上清液。
点击反应
1. 准备点击反应溶液（参见配方5）。
2. 在室温下用100μl点击溶液孵育样品30分钟。避光。
3. 用含有0.2％皂苷的PBS中的1％BSA洗涤细胞一次。旋转细胞并除去上清液。如果Trition X-100用于透化，用PBS中的1％BSA洗涤细胞。
免疫标记有丝分裂标记物，组蛋白H3磷酸Ser10
1. 将抗体磷酸化组蛋白pH3抗体（1：100，v / v）的样品在PBS中的100μl1％BSA中孵育60分钟。避光。＆nbsp;
2. 用PBS中的1％BSA洗涤细胞两次。旋转细胞并除去上清液。
3. 重悬于FACS缓冲液（1％FBS，1mM EDTA，0.05％NaN 3 的PBS溶液）中，并将细胞转移到5ml圆底聚苯乙烯FACS管中。
流式细胞术分析
1. 通过前向（FSC-A）和侧向散射谱（SSC-A）对主要细胞群进行门控，以排除细胞碎片和死细胞（图2A）。通过SSC-H和SSC-W进一步对单重态子集进行门控（图2B）。
2. 对于步骤D1中门控的细胞子集，记录至少10,000个事件的AHA掺入（y轴，alexa488）和有丝分裂标记（x轴，alexa647）（图2C）。定量基于有丝分裂标记物的荧光强度分离的间期和有丝分裂细胞（x轴）中的AHA强度（y轴）（参见步骤D4）。
  注意：准备单色（用Alexa Fluor488-AHA或Alexa Fluor 647共轭抗体染色），并且没有用于在流式细胞仪上设置FACS参数和补偿的颜色控制。在流式细胞仪上获取每个补偿控制以确定每种荧光染料组合的补偿值。该协议不包括FACS参数设置的详细说明。如需帮助，请联系您的FACS核心设施。
3. 检查阴性对照样品（蛋氨酸标记的细胞）是否显示低水平的AHA掺入（图2D）。＆nbsp;
4. 使用FlowJo量化间期和有丝分裂中单个细胞的AHA强度（例如，中值强度）。为此，请打开FlowJo并将文件（.fcs）加载到工作区中。双击工作区中的文件，将出现如图2A所示的图。如步骤D1所述，根据前向（FSC-A）和侧向散射轮廓（SSC-A）选择子集以进行进一步分析。选择相应的间期和有丝分裂群体（见图2C）并点击“工作空间”→“统计”→“中位数”→“AHA”，它计算AHA信号的中值强度。数据分析的例子如图2E所示。
  
  图2.监测间期和有丝分裂中的全球蛋白质合成。 A和B.门控策略。 C.通过磷酸-H3 S10和AHA-标记的蛋白质的双重染色进一步分析主要细胞群。通过间期和有丝分裂中的AHA掺入（y轴）监测全局蛋白质合成（基于H3 pS10染色，x轴）。 D.作为阴性对照，还监测蛋氨酸掺入蛋白质而不是AHA。 E.定量输出的实例：每个点代表在独立实验中从间期或有丝分裂细胞群计算的中值AHA强度。显示了三个独立实验的结果。

食谱

用于AHA标记的细胞培养基（不含蛋氨酸或AHA）
500毫升不含蛋氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺的DMEM
50毫升透析血清（如果使用透析血清，可以使用正常血清影响细胞生长。）
注意：
1. 只要使用不含蛋氨酸的培养基，使用正常血清代替透析血清不会显着影响脉冲标记结果。
2. 对于半胱氨酸和GlutaMAX，请遵循您使用的介质的定义浓度。
3. 在脉冲标记之前直接将甲硫氨酸或AHA添加到培养基中。
洗涤液
PBS中1％BSA＆nbsp;
修复解决方案
PBS中4％PFA
透化解决方案
PBS中含有0.2％皂苷（或0.25％Triton X-100）的1％BSA＆nbsp;
点击反应解决方案
FACS缓冲区
1％FBS
1 mM EDTA
PBS中0.05％NaN 3

笔记

您可以在96孔U型或V型底细胞培养板中进行洗涤，固定，点击反应等，以提高通量。您可以对AHA标记的细胞进行分类，分选的细胞可用于许多应用，包括蛋白质印迹分析和使用质谱法的定量分析。

致谢

我们要感谢Shuda et al。描述原始协议（Shuda et al。，2015）。我们修改并修改了本研究的方案。我们还要感谢Matthias Selbach（Max Delbruck分子医学中心）对手稿的批判性阅读和他的建议。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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Dieterich，D。C.（2010）。用于蛋白质和细胞动力学照明的化学记者。 Curr Opin Neurobiol 20（5）：623-630。
Kiick，K.L.，Saxon，E.，Tirrell，D.A。和Bertozzi，C.R。（2002）。将叠氮化物掺入重组蛋白中，通过Staudinger结扎进行化学选择性修饰。 Proc Natl Acad Sci USA 99（1）：19-24。
Shuda，M.，Velasquez，C.，Cheng，E.，Cordek，D.G.，Kwun，H.J。，Chang，Y。和Moore，P。S.（2015）。 CDK1替代mTOR激酶以激活有丝分裂帽依赖性蛋白质翻译。 Proc Natl Acad Sci USA 112（19）：5875-5882。
Sander，S.，Calado，DP，Srinivasan，L.，Ko¨chert，K.，Zhang，B.，Rosolowski，M.，Rodig，SJ，Holzmann，K.，Stilgenbauer，S.，Siebert，R。， Bullinger L.，Rajewsky K.（2012）。在Burkitt淋巴瘤生成中PI3K信号与MYC之间的协同作用。癌症Cell 22：167-179。