材料和试剂

常见实验室耗材

移液器提示＆nbsp;
手套＆NBSP;
容量为50毫升的塑料容器（用于清洗阵列）
保鲜膜
吸水实验室擦拭巾（KimWipes ®或同等产品）＆nbsp;
纸巾
塑料透明板材保护膜（修剪至10厘米x 12厘米，三面开口）＆nbsp;
TissueRuptor一次性探针（QIAGEN，目录号：990890）

试剂制备（小鼠磷酸化RTK阵列试剂盒）

Proteome Profiler Mouse Phospho-RTK Array Kit（R＆amp; D Systems，目录号：ARY014）
套件内容：
1. 4阵列膜
2. 4井多盘
3. 数组缓冲区：
  
  1）
  裂解缓冲液17（见食谱）
  
  2）
  数组缓冲区1
  
  3）
  1x阵列缓冲区2（参见食谱）
  
  4）
  1x洗涤缓冲液（见食谱）
  
  5）
  Chemi Reagent Mix（见食谱）
4. 裂解缓冲液
5. 洗涤缓冲液
6. 抗磷酸酪氨酸-HRP检测抗体
7. 化学发光检测试剂
8. 透明度叠加模板
9. 详细议定书
注意：将未开封的试剂盒存放在2°C至8°C。请勿使用过去的工具包到期日期。
抑肽酶（西格玛，目录号：A6279）
Leupeptin（Tocris，目录号：1167）
Pepstatin（Tocris，目录号：1190）

Western Blots的材料和试剂

PDVF膜
CL-XPosure TM 薄膜，5 x 7英寸（13 x 18厘米）（Thermo Fisher Scientific，目录号：34090）
4x Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610747）
4％-20％Mini-PROTEAN ® TGX无染色 TM 蛋白凝胶，12孔，20μl（Bio-Rad Laboratories，目录号：4568095）
用于蛋白质印迹和天然凝胶的10x Tris /甘氨酸缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610771）
10x Tris / Glycine / SDS（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610772）
甲醇ACS试剂，≥99.8％（Sigma，目录号：179337）
Pierce TM BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Scientific，目录号：23227）
Blotting级阻滞剂，脱脂奶粉（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706404）
吐温20,100％非离子洗涤剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706531）
TBS Buffer，20x液体（VWR，目录号：97064-338）
恢复 TM PLUS Western Blot Stripping Buffer（Thermo Scientific，目录号：46430）
SuperSignal TM West Pico PLUS化学发光底物（Thermo Scientific，目录号：34577）
原发性抗体：
cKIT和p-cKIT（Cell Signaling Technology，目录号：9370）
PDGFRA和p-PDGFRA（R＆amp; D Systems，目录号：AF307和AF2114）
HRP标记的二抗（Promega，目录号：W4011）
去离子水或蒸馏水
1x Tris / Glycine运行缓冲液（见食谱）
转移缓冲区（见食谱）
1x TBS（1升）（见食谱）
TBS / Tween（见食谱）
5％吸墨级阻滞剂，脱脂奶粉/ TBS / Tween（见食谱）

设备

移液器（Gilson，Pipetman Classic）
扁镊子
放射自显影盒
摇摆平台振动筛
TissueRuptor II（QIAGEN，目录号：9002755）
离心机5810R（Eppendorf，目录号：5811000010）
电影开发商Alphatek AX-390-SE（Alphatek）
摇摆平台振动器

软件

用于ImageJ的蛋白质阵列分析仪（作者：Gilles Carpentier，Faculte des Sciences et Technologies，Universite Paris Est Creteil Val de Marne，France， https://imagej.nih.gov/ij/macros/toolsets/Protein%20Array%20Analyzer.txt ）
GraphPad Prism 7.0a（GraphPad Software，Inc.， www.graphpad.com ）

程序

试剂制备（小鼠磷酸化RTK阵列试剂盒）
注意：使用前将所有试剂置于室温下。
1. 小鼠Phospho-RTK阵列
  四个硝酸纤维素膜，每个含有39种不同的抗RTK抗体，一式两份印刷。只戴戴手套的手和平头镊子处理阵列。＆nbsp;
2. 抗磷酸酪氨酸-HRP检测抗体：50μl与HRP结合的小鼠抗磷酸酪氨酸抗体
  在使用前，立即使用1x阵列缓冲液2将检测抗体稀释至样品瓶标签上指定的工作浓度。
  注意：根据需要准备尽可能多的检测抗体来进行每个实验。
3. 裂解缓冲液17（参见配方5）
4. 1x阵列缓冲器2（参见配方6）
5. 1x洗涤缓冲液（参见配方7）
6. Chemi Reagent Mix（见食谱8）
样品制备
1. 通过解剖切除并使用TissueRuptor II在1ml用蛋白酶抑制剂制备的裂解缓冲液17中破坏1-5mg肿瘤组织（约0.2-0.3cm 3 ）。＆nbsp;
2. 在Eppendorf离心机5810R中，在4℃下以10,621 x g 离心样品10分钟。＆nbsp;
3. 使用Pierce TM BCA蛋白质测定试剂盒收集肿瘤裂解物中的上清液和定量的蛋白质浓度。
注意：
1. 组织裂解液的建议起始范围为100-300μg，最大允许裂解液体积为250μl/阵列。
2. 组织裂解液应立即使用或等分并在≤-70°C下储存。
3. 解冻裂解液应在使用前保存在冰上。
阵列程序
注意：使用前将所有试剂置于室温。将样品保存在冰上。为避免污染，请在执行操作时戴上手套。
1. 按照前面部分的说明准备所有试剂和样品。＆nbsp;
2. 移取2.0ml阵列缓冲液1到将要使用的4孔Multi-dish的每个孔中。数组缓冲区1用作块缓冲区。＆nbsp;
3. 使用平头镊子，从保护板之间移除要使用的每个阵列。＆nbsp;
4. 将一个阵列放入4孔多盘的每个孔中。阵列号应朝上。
  注意：与阵列缓冲液1接触后，蓝色染料将从斑点消失。捕获抗体保留在其特定位置。＆nbsp;
5. 在摇床平台振荡器上在室温下孵育1小时。调整托盘的方向，使每个阵列在其井中从一端到另一端摇摆。＆nbsp;
6. 当阵列阻塞时，通过在1.25ml阵列缓冲液1中稀释所需量的裂解物来制备样品。根据需要用裂解缓冲液17调节至终体积1.5ml。最大允许裂解液体积为250μl/阵列。＆nbsp;
7. 从4孔多盘中吸出阵列缓冲液1。加入准备好的样品，盖上4孔Multi-dish。＆nbsp;
8. 在摇动平台振荡器上于2-8°C孵育过夜。
  注意：如果不需要最佳灵敏度，可以使用较短的孵育时间。＆nbsp;
9. 小心地取出每个阵列，放入装有20毫升1x洗涤缓冲液的塑料容器中。用去离子水或蒸馏水冲洗4孔Multi-dish并彻底晾干。＆nbsp;
10. 在摇动平台振荡器上用1x洗涤缓冲液洗涤每个阵列10分钟。重复两次，共洗三次。＆nbsp;
11. 使用样品瓶标签上的稀释因子稀释1x阵列缓冲液2中的抗磷酸酪氨酸-HRP检测抗体。移取2.0毫升到4孔多盘的每个孔中。＆nbsp;
12. 小心地从洗涤容器中取出每个阵列。允许多余的缓冲液从阵列中排出。将阵列放回含有抗磷酸酪氨酸-HRP的4孔Multi-dish中，盖上盖子。＆nbsp;
13. 在室温下在摇动平台振荡器上孵育2小时。＆nbsp;
14. 按照步骤C9和C10中的描述清洗每个阵列。
  注意：不间断地完成剩余的步骤。＆nbsp;
15. 小心地从洗涤容器中取出每个膜。通过将下边缘吸到纸巾上，让多余的洗涤缓冲液从膜上排出。将每个薄膜放在塑料薄膜保护膜的底部薄片上，标识号朝上。＆nbsp;
16. 将1ml制备的Chemi Reagent Mix均匀地移液到每个膜上。
  注意：每个膜使用少于1 ml的Chemi Reagent Mix可能导致膜覆盖不完整。
17. 小心地盖上塑料薄膜保护膜的顶层。轻轻抚平任何气泡，确保Chemi Reagent Mix均匀涂抹在每个膜的各个角落。孵育1分钟。＆nbsp;
18. 将纸巾放在含有膜的塑料薄膜保护膜的顶部和侧面，并小心地挤出多余的Chemi Reagent Mix。＆nbsp;
19. 取下顶部的塑料薄膜保护膜，小心地在薄膜顶部铺上吸收性实验室擦拭物，以去除任何残留的Chemi Reagent Mix。＆nbsp;
20. 将薄膜留在底部塑料薄膜保护膜上，用保鲜膜覆盖薄膜，小心地平滑任何气泡。将多余的塑料包裹物缠绕在纸张保护装置的背面，使膜和纸张保护装置完全包裹。＆nbsp;
21. 将识别号朝上的膜置于放射自显影胶片盒中。
  注意：使用不与放射性同位素检测一起使用的放射自显影盒。
22. 暴露膜CL-XPosure TM 膜。建议多次曝光时间（图1）。
  
  图1.小鼠KSHV诱导的KS样肿瘤中受体酪氨酸激酶的蛋白质组学分析显示PDGF受体-α的激活。小鼠磷酸受体酪氨酸激酶（RTK）阵列试剂盒用于量化磷酸化水平在小鼠KSHV诱导的KS样肿瘤中的39个RTK。注意对应于PDGF受体α链的主要活化斑点（Cavallin 等人，，2018）。

数据分析

通过将透明度覆盖模板放置在阵列图像上并将其与每个阵列的三个角中的参考点对对齐，可以快速识别在显影胶片上看到的正信号。阵列上标记的标识号应放在左侧。控制和捕获抗体的位置列于附录中。

注意：

包含参考斑点以对齐透明度覆盖模板，并证明在测定过程中阵列已与抗磷酸酪氨酸-HRP一起孵育。＆nbsp;
可以使用传输模式扫描仪和图像分析软件收集和分析开发的X射线胶片上的像素密度。

使用ImageJ Protein Array Analyzer工具创建一个模板来分析数组每个点的像素密度。＆nbsp;
将信号值导出到电子表格文件，以便在Microsoft Excel或GraphPad Prism等程序中进行操作。＆nbsp;
确定代表每个RTK的一对重复点的平均信号（像素密度）。＆nbsp;
从每个RTK中减去平均背景信号。使用来自阵列清晰区域或PBS阴性对照点的信号作为背景值（图2）。

图2.图1中45分钟曝光阵列的定量。高密度测定法的条形图和饼图对于最显着的信号同样采用颜色编码（Cavallin et al 。，2018）。

Western Blotting
将20微克用于小鼠磷酸化RTK阵列的相同肿瘤裂解物的蛋白质与Laemmli缓冲液混合，煮沸5分钟，通过SDS-PAGE在4-20％Mini-PROTEAN ® TGX中分离无染色 TM 蛋白凝胶，12孔。通过在300mA下印迹过夜将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5％脱脂乳/ TBS / Tween 20封闭膜1小时，并与一抗孵育（4℃，16小时）。在3次TBS / Tween 20洗涤后，将膜与HRP标记的第二抗体（1：10,000稀释）在室温下孵育1小时。使用SuperSignal TM West Pico PLUS化学发光底物开发蛋白质条带。为了分析同一膜上的多种蛋白质，根据制造商的方案用Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer洗涤膜（图3）。

图3.验证小鼠磷酸受体酪氨酸激酶（RTK）阵列试剂盒。 PDGFRA和磷酸化PDGFRA（A）或c-KIT和磷酸化cKIT（B）在3个不同的样品中测定通过免疫印迹从小鼠正常皮肤和小鼠KSHV诱导的来自3只不同小鼠的KS样肿瘤（Cavallin 等，，2018）。（C）GAPDH用作加载对照。

食谱

1x Tris /甘氨酸缓冲液（1 L）
100毫升10倍Tris /甘氨酸
900毫升蒸馏水
转移缓冲液（1升）
100毫升10倍Tris /甘氨酸/ SDS
200毫升甲醇
700毫升蒸馏水
1x TBS（1升）
50毫升20倍TBS
950毫升蒸馏水
TBS /吐温（500毫升）
25毫升TBS 20x
1毫升吐温20
蒸馏水至500毫升
5％印迹级阻滞剂，脱脂奶粉/ TBS / Tween（10 ml）
500毫克印迹级阻滞剂，脱脂奶粉
10毫升TBS / Tween

注意：使用前将所有试剂置于室温下。

Lysis Buffer 17
将10μg/ ml抑肽酶，10μg/ ml Leupeptin和10μg/ ml Pepstatin加入到细胞裂解液制备所需的裂解缓冲液17中。
每次使用都要准备新鲜的
1x阵列缓冲器2
将2 ml Array Buffer 2浓缩液加入8 ml去离子水或蒸馏水中为每次使用准备新鲜
1x洗涤缓冲液
如果在浓缩物中形成晶体，将瓶子加热至室温并轻轻混合直至晶体完全溶解将40ml 25x洗涤缓冲液浓缩物稀释到960ml去离子水或蒸馏水中
Chemi Reagent Mix
Chemi试剂1和2应在使用15分钟内以相同的体积混合（避光）
每个膜需要1ml所得混合物

致谢

这项工作得到NIH拨款CA75918和CA136387的支持;并通过迈阿密CFAR资助5P30AI07396的NCI / OHAM补充，以及佛罗里达生物医学基金会，Bankhead Coley Foundation Grant 3BB05。

利益争夺

作者没有任何利益冲突或竞争利益。

伦理

动物实验已在UM IACUC批准号13±093下进行。迈阿密大学向美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室（OLAW）提交动物福利保证。此外，UM已在USDA APHIS注册。实验动物管理评估和认证协会（AAALAC International）认证委员会继续对迈阿密大学进行全面认证。

参考

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