材料和试剂

标准平底96孔板（Sarstedt AG＆amp; Co.，目录号：82.1581）
螺帽500μl微量离心管（BioBasic，目录号：TC132-SN）
300μlmicrosinsertHPLC样品瓶（Chromatogaphic Specialties，目录号：C73302101232）
1.5 ml微量离心管（BioBasic，目录号：BT620NS）
15毫升离心管（VWR，目录号：89401-568）
50毫升离心管（VWR，目录号：76176-956）
铝箔（Fisher，目录号：01-213-101）
乙腈，HPLC级（VWR，目录号：CABDH83639.400）
水，HPLC级（VWR，目录号：CABDH23595.400）
三氟乙酸，HPLC级（VWR，目录号：CATX1276-6）
2-硫代巴比妥酸（默克密理博中国，目录号：108180）
丙二醛二（二乙基乙缩醛）（4℃，12个月）（Sigma-Aldrich，目录号：T9889）
丁基羟基甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：B1378）
三氯乙酸6.1 N（Sigma-Aldrich，目录号：T0699）
尿酸酶（-20°C，12个月）（西格玛奥德里奇，目录号：U0880）
六水合氯化铁（BioBasic，目录号：FD0201）
硫酸亚铁（BioBasic，目录号：FB0461）
醋酸钠三水合物（BioBasic，目录号：SB0481）
乙酸，冰川（VWR，目录号：CA71006-424）
TPTZ（Sigma-Aldrich，目录号：T1253）＆nbsp;
NPD（Sigma-Aldrich，目录号：193992）
12.5％次氯酸钠（在黑暗中储存，12个月）（VWR，目录号：BDH7038-4L）
盐酸（HCl）（VWR，目录号：CA11020-884）
硫酸（VWR，目录号：CA11024-170）
氢氧化钠（NaOH）（VWR，目录号：BDH9292）
无水乙醇（商用醇，目录号：P016EAAN）
0.1 M丁基化羟基甲苯（BHT）溶液（见食谱）
15％三氯乙酸溶液（见食谱）
2 N NaOH溶液（见食谱）
2-硫代巴比妥酸溶液（见食谱）
0.25 M HCl溶液（见食谱）
尿酸酶原液（见食谱）
Uricase工作解决方案（见食谱）
醋酸盐缓冲溶液（见食谱）
400 mM HCl盐溶液（参见食谱）
40 mM HCl溶液（见食谱）
TPTZ解决方案（见食谱）
氯化铁溶液（见食谱）
30 mM硫酸亚铁储备液（参见食谱）
FRAP试剂（见食谱）
NPD储备液（见食谱）
0.6 M硫酸溶液（见食谱）
氧化剂溶液（见食谱）

设备

100毫升容量瓶，A级（VWR，目录号：10124-072）
500毫升容量瓶，A级（VWR，目录号：10545-998）
1升容量瓶，A级（VWR，目录号：10546-000）
琥珀色瓶（VWR，目录号：89221-624）
冰浴（VWR，目录号：10146-190）
水浴（VWR，目录号：89501-464）
通风橱（VWR，目录号：89260-062）
磁力搅拌器（VWR，目录号：97042-634）
分析天平（VWR，目录号：10205-026）
iMark Filter吸光度酶标仪（Bio-Rad，目录号：1681135）
用于酶标仪的515 nm滤光片（Bio-Rad，目录号：1681033）
注意：如果没有515 nm滤光片，则510-520 nm范围内的替代滤光片就足够了。>
1100系列二元泵（Agilent Technologies，型号：G1312A）
1100系列自动进样器（Agilent Technologies，型号：G1313A）
1100系列柱温箱（Agilent Technologies，型号：G1316A）
1100系列可变波长检测器（Agilent Technologies，型号：G1315A）
ODS2 250 x 4.6 mm5μmHPLC柱（Waters Corp.，目录号：PSS831915）＆nbsp;
涡旋混合器（VWR，目录号：10153-842）
摇晃干块（Eppendorf，VWR，型号：Thermomixer，目录号：CA11028-280）
Barnstead E-Pure水系统（Barnstead，Thermo Fisher，型号：E-Pure）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5418R）
微量移液器（Eppendorf，目录号：2231000601）
分光光度计（Thermo Fisher，型号：Genesys10S）
pH计（VWR，目录号：89231-662）
4°C冰箱（VWR，目录号：89239-070）
-20°C冰柜（VWR，目录号：10819-408）
-80°C冰箱（VWR，目录号：10160-740）

软件

OpenLab色谱数据系统（Agilent Technologies， http://www.agilent.com/ ）
Microplate Manager 6（Bio-Rad Laboratories Canada Ltd.， http://www.biorad.com/ ）

程序

MDA定量
注意：>
a。现场样品应在收集后直接在血细胞比容离心机中旋转，以分别储存血浆。我们建议将分离的血浆转移到0.5 ml离心管中进行储存。有关现场采样的更多详细信息，请参见Langille等，2018。 >
b。在分析前将样品保存在-80°C，并在收集后一年内进行测试。 >
c。一个HPLC系统和两名工作人员可以在一个工作日内处理校准曲线和大约20-30个血浆样本。＆nbsp; >
1. 使用表1中列出的参数准备HPLC系统。＆nbsp;
  
  表1.用于MDA定量方法的HPLC系统参数
2. 通过将100mM 1,1,3,3-四乙氧基丙烷储备溶液加入100ml容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，制备1.00mM MDA工作溶液。混合均匀。＆nbsp;
3. 通过使用微量移液管连续稀释新制备的1.00mM 1,1,3,3-四乙氧基丙烷工作溶液来制备MDA校准。在每批样品之前准备新的校准曲线。见表2.＆nbsp;
  
  表2.用于MDA定量方法的连续稀释的1,1,3,3-四乙氧基丙烷标准品的制备
4. 将标准品存放在冰上直至使用。＆nbsp;
5. 在冰上解冻血浆样品，并在3000 x g >和4°C的冷冻离心机中旋转1分钟，以收集管底部的血浆。＆nbsp;
6. 准备标准的1.5 ml微量离心管，样品和标准品标签。
  注意：我们希望一式三份运行，因此我们购买了一台标签打印机，可以更轻松地重复标记管道。>
7. 将20μl标准或血浆样品转移到标记的试管中。＆nbsp;
8. 向每个试管中加入2μl丁基化羟基甲苯（BHT）溶液（参见配方）和5μl2NNaOH溶液（参见配方）。＆nbsp;
9. 简单地涡旋管，然后转移到设定在60℃的摇动干燥块培养箱中30分钟并以400rpm搅拌。
10. 完成后，将管子移到冰桶中，加入100μl15％三氯乙酸溶液沉淀蛋白质。＆nbsp;
11. 将样品短暂涡旋，然后在冰浴中孵育5分钟。
12. 将管在14,000 x g >和4°C离心10分钟以沉淀蛋白质。
13. 小心地，在不干扰蛋白质沉淀的情况下，将100μl上清液转移到500μl螺旋盖微量离心管中。
14. 在该试管中，还加入50μl2-硫代巴比妥酸衍生溶液（见食谱）。＆nbsp;
15. 确保管上的盖子密封良好，置于100℃的干燥块培养箱中60分钟。
16. 将试管从块中取出放入冰浴中，冷却后，以14,000 x g >和4°C离心5分钟。
17. 将60μl衍生化溶液转移至微插入HPLC小瓶中。
18. 除标准品外，将5μl衍生化溶液转移至合并的QC小瓶中。
  注意：QC是您将在一天内处理的所有血浆的汇集样本。在整个HPLC运行过程中（每8-10个样品）注入此QC将允许您观察样品的运行或分解是否存在任何问题。>
19. 在样品制备的12小时内将小瓶进行HPLC分析，一式三份。＆nbsp;
FRAP检测
注意：>
a。样品应在分析前储存在-80°C并在冰上解冻。>
b。 FRAP试剂对光敏感，在环境空气中不稳定。试剂必须在使用前直接制备。＆nbsp; >
1. 通过在15ml离心管中用9ml蒸馏水稀释1ml 300mM原液来制备工作硫酸铁溶液。使用这种30 mM溶液在15 ml离心管中制备校准溶液（见表3）。
  
  表3. FRAP测定的硫酸铁标准品稀释表
2. 获得标准的平底96孔板，并计划校准曲线的位置和样品的位置。我们希望每个板运行2条校准曲线以解决错误。＆nbsp;
3. 将5μl等分试样的标准品或样品移液到每个待测孔中，然后用5μl含有尿酸酶的超纯水（1.00U / ml，参见配方）。确保两滴混合均匀。＆nbsp;
4. 将该溶液在室温下在轨道振荡器上以100rpm孵育5分钟。
5. 使用多通道移液器向每个孔中加入200μlFRAP试剂（参见食谱）。＆nbsp;
6. 将平板放入酶标仪中，低速摇动30分钟，在软件上显示为“LO”。＆nbsp;
7. 30分钟后，读取595nm处的吸光度与试剂空白。＆nbsp;
HASC检测
注意：>
a。样品应在分析前储存在-80°C并在冰上融化。 >
b。氧化剂溶液在空气中不稳定，应小心制备。 pH值的调节应在通风橱中进行，因为会产生少量的氯气。 >
1. 如配方部分中那样准备氧化剂溶液。将瓶子用铝箔包裹，保护溶液免受光照，并迅速使用溶液。＆nbsp;
2. 从氧化剂溶液中，通过稀释1x至2x，4x，8x，16x和32x稀释液来制备HClO的校准曲线。准备1毫升的每种溶液。＆nbsp;
3. 向标准96孔平底微孔板中加入1μl血浆或标准和100μl超纯水。
  注意：我们希望每个板至少运行两条校准曲线，以解决可能发生的任何错误。＆nbsp; >
4. 将板在400振荡器上以400rpm涡旋30秒。＆nbsp;
5. 使用多通道移液器，仅在样品孔中加入100μl氧化剂溶液。
  注意：不要在标准孔中加入氧化剂溶液。该标准直接读作HClO的连续稀释液。相反，加入100μl超纯水。>
6. 在轨道振荡器上将板在室温和100rpm下摇动10分钟。＆nbsp;
7. 向板的每个孔中加入20μlNPD溶液（参见配方）。＆nbsp;
8. 将板在轨道振荡器上在室温和100rpm下孵育1分钟。
9. 读取515nm处孔的吸光度。

数据分析

MDA量化
该软件自动整合3.00分钟时TBA 2 -MDA加合物的面积。导出此数据并使用它来准备校准曲线并量化样品。然后使用标准线性校准对其原始格式的平均三份重复数据进行定量（参见Langille et al。>，2018）。
FRAP检测
输出孔的吸光度数据并取一式三份孔的平均值。使用此数据准备线性校准和量化样品（参见Langille et al。>，2018）。
HASC检测
输出孔的吸光度数据并取一式三份孔的平均值。使用此数据准备线性校准和量化样品（参见Langille et al。>。，2018）。

笔记

2-硫代巴比妥酸受加拿大受控药物和物质法（CDSA）控制，因此需要获得许可才能获得并拥有该化合物。申请必须通过加拿大卫生部提交，以获得采购2-硫代巴比妥酸的授权。在美国，2-硫代巴比妥酸不受控制，可从Sigma-Aldrich购买。
重要的是要注意在整个实验过程中使用微量移液器，因此研究人员应接受良好的移液技术培训，并对移液器感到舒适。实施良好的技术至关重要，因为处理的解决方案非常少，因此如果移液器没有提供准确的体积，任何错误都会被放大。＆nbsp;
应使用良好的分析技术制备所有溶液。如果您计划为一项研究处理大量样本，建议为该研究准备一次库存，以尽量减少同一溶液的几种制剂之间的差异。＆nbsp;
每个紫外检测器或酶标仪的线性范围可根据型号，年龄等>而变化。在处理血浆样品之前，检查系统是否提供线性校准非常重要。＆nbsp;
用以下方式计算评估方法性能的品质因数：相对标准偏差（％RSD）是标准偏差除以相同样品的三个单独制剂（和每个制剂三次注射）的平均值。通过测量空白注射的噪声来计算检测限（LOD）和定量限（LOQ）。 LOD和LOQ分别定义为空白噪声水平的3倍和10倍。＆nbsp;
使用该方法，MDA校准曲线的线性度为1.25-20μM（％RSD = 0.32，n = 7）。 LOD和LOQ分别为0.06和0.125μM。批间变异（％RSD = 9.31，n = 48）代表实验室测量误差。我们没有获得QC样品随时间的显着增加（β=0.0195μM/小时，r 2 = 0.017，n = 8）。 QC量化与每天评估的所有个体的平均值相比，显示对不同分析天数的结果几乎没有影响（斜率= 0.99，r 2 = 0.98，n = 9）。示例色谱图显示在Langille et al。>，2018中。＆nbsp;
对于开发的不依赖于尿酸的FRAP测定，校准曲线的线性度（0.5-3mM FeSO 4 ）高（％RSD = 2.50，n = 7）。批间变异（％RSD）为5.82（n = 57）。＆nbsp;
适应性HASC测定的校准曲线的线性范围为0.03-0.5mM HClO，高（％RSD = 3.64，n = 4）。批间变异（％RSD）为2.03（n = 32）。＆nbsp;
如果您使用的是基于单色仪的分光光度计或酶标仪，您只需使用本文中建议的波长进行测量即可。

食谱

0.1M丁基化羟基甲苯（BHT）溶液
1. 将2.20g丁基化羟基甲苯溶于100ml无水乙醇中
2. 该解决方案可能需要短暂的超声处理以帮助快速溶解
3. 储存：RT，保质期：3个月
15％三氯乙酸溶液
1. 在通风橱中，将15 ml 6.1 N（100％w / v）三氯乙酸溶液缓慢加入85 ml超纯水中
2. 简单地涡旋混合
3. 储存：RT，保质期：3个月
2 N NaOH溶液
1. 将8g NaOH颗粒溶解在100ml超纯水中
2. 用磁力搅拌板搅拌直至颗粒完全溶解
3. 储存：RT，保质期：3个月
2-硫代巴比妥酸溶液
1. 将0.375g 2-硫代巴比妥酸溶于100ml 0.25M HCl中
2. 在50℃的水浴中加热10分钟，然后超声处理5分钟以帮助快速溶解
3. 储存：4°C，保质期：3个月
0.25 M HCl溶液
1. 在通风橱中，将10.4 ml 12 M（浓）HCl缓慢加入500 ml容量瓶中，装有300 ml超纯水
2. 旋转混合并稀释至标记
3. 储存：RT，保质期：3个月
Uricase股票解决方案
1. 在冰上孵育15ml超纯水以冷却，然后制备溶液。使用尿酸酶提供的分析证书，计算准备1,000 U / ml储备所需的质量
2. 使用分析天平，在分析天平上仔细称重粉末至最接近的0.1 mg
3. 使用微量移液管加入1ml预先冷却的水，并通过缓慢地上下移液来溶解。不要涡旋！酶的溶液不应该被涡旋
4. 储存：-20°C，保质期：12个月
Uricase工作解决方案
1. 使用微量移液管将1μl的1,000 U / ml加入到999μl预冷的超纯水中，稀释Uricase原液
2. 不要涡旋，轻轻颠倒管子几次混合＆nbsp;
3. 储存：冰上，保质期：每日准备
醋酸盐缓冲溶液＆nbsp;
1. 在通风橱中，将500毫升超纯水加入1升容量瓶中。然后缓慢加入16毫升冰醋酸，接着加入2.70克三水合乙酸钠
2. 使用磁力搅拌器混合溶液并稀释至烧瓶上标记下方约10ml
3. 使用已校准pH值为4和7的台式pH计检查pH值.pH值应为3.6。如果pH高于3.6，则通过逐滴加入乙酸酸化溶液。如果pH值低于3.6，则加入醋酸钠提高pH值。＆nbsp;
4. 储存：4°C，保质期：1个月
400 mM HCl盐溶液＆nbsp;
1. 在通风橱中，向含有300ml超纯水的500ml容量瓶中缓慢加入16.5ml浓HCl
2. 旋转混合并稀释至标记
3. 储存：RT，保质期：6个月
40 mM HCl溶液＆nbsp;
将100毫升400毫克储备溶液与900毫升超纯水混合
储存：RT，保质期：1周
TPTZ解决方案
1. 在100ml容量瓶中，将0.3123g TPTZ溶于100ml如上制备的40mM HCl中
2. 可能需要将溶液置于50°C水浴中以帮助溶解
3. 储存：4°C，保质期：1个月
氯化铁溶液＆nbsp;
1. 在通风橱中，向1L容量瓶中加入500ml 40mM HCl，加入5.41g六水合氯化铁，在磁力搅拌板上搅拌直至溶解。
2. 用40mM HCl将溶液稀释至刻度。需要酸来防止亚铁离子的水解和沉淀
3. 溶液应储存在琥珀色瓶中，最长可保存两个月。如果发现形成红褐色沉淀，则必须处理溶液并再次进行准备
30 mM硫酸亚铁储备溶液＆nbsp;
将0.834克硫酸亚铁七水合物溶于100毫升超纯水中储存：4°C，保质期：1个月
FRAP试剂＆nbsp;
1. 使用前将以下物质直接混合在冰上的50 ml离心管中：
  20毫升醋酸盐缓冲液
  2毫升TPTZ sol'n
  2毫升FeCl 3 sol'n
  2.4ml dH 2 O.
2. 通过涡旋混合试剂。溶液应为稻草色，如果是蓝色，则丢弃并再次准备
3. 储存：冰浴，保质期：1-2小时
NPD库存解决方案
1. 移取83μl纯NPD到含有50ml无水乙醇的50ml离心管中
2. 用铝箔包裹管子以防止光线照射。使用涡旋混合器混合
3. 储存：4°C，保质期：3个月
0.6 M硫酸溶液
1. 在通风橱中，加入16.6毫升浓缩液。将硫酸缓慢加入装有300ml超纯水的容量瓶中
2. 稀释至标记并通过反转混合
3. 储存：RT，保质期：3个月
氧化剂溶液
1. 打开分光光度计，让灯泡在启动前保温30分钟。在通风橱中，向含有300毫升超纯水的500毫升容量瓶中加入1毫升10％次氯酸钠
2. 稀释至标记并通过反转混合
3. 将100 ml此溶液转移至250 ml培养瓶中，插入已在pH 4和7下校准的pH探针。在适度磁力搅拌下，小心地加入0.6 M硫酸溶液直至pH达到6.2
4. 使用1 cm光程的石英比色皿，测量所得溶液的吸光度与292 nm处水空白的吸光度
5. 使用以下公式应用Beer-Lambert定律：
  
  A =ε×l×c > >
  其中，HClO的摩尔吸光系数（ε）为350 L mol -1 cm -1 ，细胞的光程（l）为1 cm，吸光度（ A）在292nm处读数。然后可以解决HClO的浓度（c）。

致谢

我很感谢Patrick Bergeron，Vincent Lemieux，Dany Garant和DenisRéale在该领域的样品采集。这项研究由加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）资助PB和DG以及魁北克生物多样性科学中心（QCBS）种子资助PB和DG。 VL得到了魁北克省自然科学基金会（FRQNT）的奖学金资助。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益存在。

伦理

道德批准来自加拿大动物保护委员会（＃A2016-01-Bishop's University）和魁北克省自然保护区（＃2017-05-01-102-05-S-F）。

参考

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Di Silvestro，R.，Di Loreto，A.，Bosi，S.，Bregola，V.，Marotti，I.，Benedettelli，S.，Segura-Carretero，A。和Dinelli，G。（2017）。环境和基因型对有机种植小麦品种抗氧化特性的影响：为期3年的研究。 J Sci Food Agric > 97（2）：641-649。
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