材料和试剂

剃刀刀片（VWR，目录号：55411-055）
1.5 ml microtubes（Phenix Research Products，目录号：MH-815）
大鼠（例如>，Wistar大鼠，8周龄;查尔斯河）
95％（v / v）乙醇（Decon Labs，Koptec，目录号：V1105）
醇氧化酶/缓冲试剂（Analox Instruments，目录号：GMRD-113）
100％（v / v）乙醇（Decon Labs，Koptec，目录号：V1001G）＆nbsp;
Liquinox（Alconox，目录号：1232）

设备

预装酒精蒸气吸入系统（La Jolla Alcohol Research，Inc。）或等效的自制系统
高速微量离心机（Fisher Scientific，AccuSpin Micro 17，目录号：13-100-675）
Analox AM1分析仪（Analox Instruments，P-GM7Micro-Stat，目录号：Analox-AM1）
五加仑carboy（Fisher Scientific，Thermo Scientific Nalgene Carboy，目录号：02-960-20A）
带定时器的电源板（世纪，型号：BNC-U1）
动物秤（OHaus，Valor 3000 Xtreme，型号：V31XH2）

程序

通过确保预组装的空气和真空管路和压力表牢固地连接到蒸汽吸入系统的空气和真空管路来准备蒸汽室（图1）。
将乙醇输送管线连接到含有95％（v / v）乙醇的5加仑汽车，并固定盖子（图1A）。
注意：不要使用100％乙醇，因为它对动物有毒，并且不使用变性的乙醇或含有甲基乙基酮（MEK），苯甲酸地那铵或苯甲酸盐。>

图1.组装蒸汽吸入系统。 A.完整系统。将95％（v / v）乙醇从5加仑的carboy储器（a）输送到玻璃烧瓶（b）。加热元件用于产生乙醇蒸汽，其通过进入的空气管线输送到容纳在装置中的笼子。输送到笼子的空气温度不会因此过程而明显改变。通过空气管线输送的乙醇量由泵（c）控制，泵（c）控制乙醇输送到加热烧瓶的频率和体积，在那里蒸发。通过空气压力计（d）监测空气流量。 B.泵的特写图像。 C.加热元件的特写图像，加热元件的电源和气压计。
根据动物体重和所需BAL将泵设置调整到所需水平。
注意：这些设置可以由制造商提供的一般规则指导。最好从较低的泵设置开始，并在第一周的过程中逐渐增加BAL，而不是让大鼠从第一阶段的高BAL开始（参见表1的例子）。有关泵设置的更多注意事项，请参阅本协议的“注释”部分。>
将电源板上的计时器设置为所需的设置。在我们的实验中，乙醇泵（插入电源板）每天开启14小时，每天关闭10小时。
注意：蒸汽开/关时间可能不同，但实验要求可能决定了这个时间表。实验者应该能够在“蒸汽开”和“蒸汽关闭”阶段的特定时间点接近动物以测量BAL（至少每周一次，更经常在暴露开始时）和行为测试。对于我们的实验，我们经常在下午6:00将蒸汽设置为开启，并在上午8:00设置蒸汽关闭，行为测试在下午3:00左右进行。我们的蒸汽室中的灯在上午8:00关闭，这意味着大部分酒精蒸气暴露发生在灯光循环期间，测试发生在黑暗循环期间。>
取下老鼠家笼的盖子，但保持电线盖上有食物和水库。将保持架插入蒸汽吸入系统并固定外壳。
注意：当动物在蒸汽吸入系统内时，从不关闭进入蒸汽吸入系统的空气。如果气压下降（可通过气压计检测到），请立即取下保持架。当将CIE与利用可重复程序的行为实验相结合时，理想的是收集基线行为数据（> 例如> ，使用Hargreaves装置进行伤害感受的后爪退缩阈值，或杠杆按压操作性自我管理研究;应收集基线数据，直到个体行为稳定到会话之间的变异性在20％之内），并使用这些数据将大鼠分配给基线行为数据平衡的“蒸气”或“空气”暴露组。在第一次暴露于蒸气之前和整个CIE程序（> 例如> ，每周两次）之前，应对大鼠进行称重。>
进行蒸汽暴露，并监测BAL。在蒸汽第一次训练后的蒸汽关闭时间点，通过目视评估大鼠在家中的躯体症状（例如>，步态，呼吸，运动）来监测大鼠中毒（例如< / em>，Nixon and Crews，2002）。使用剃刀刀片，在尾巴尖端切开血液进行采血;轻轻地向尾巴长度施加压力以促进血液流动，并使用1.5 ml微管从每只动物采集血液（根据用于测量BAL的测定，所需的体积可能不同;对于我们的实验，我们收集~100μl ）。这个程序可以在最小的限制下进行;将大鼠放在实验者的非优势手臂上，鼓励大鼠的头部位于肘部和身体之间，并使用非惯用手固定老鼠的尾巴。将大鼠的尾巴放在无菌的表面上，并用惯用的手来划伤尾巴的尖端。收集血液后，将老鼠送回家中。还应从暴露在空气中的对照中采集血液，以配合此程序的压力。
注意：可以使用含有肝素或其他抗凝血剂的微管;这些不应该干扰使用Analox系统的BAL测量（步骤7）。每次更改酒精泵设置时，都应收集血液以测量新设置的BAL。应重复该过程，直到大鼠达到所需的BAL范围（在我们的工作中，通常为150-200mg / dl）。在达到目标BAL范围后，应该每周至少测量一次BAL以检测并解释设置中的代谢耐受性和/或潜在漂移。由于大鼠在反复接触后会对酒精产生代谢耐受，因此可能需要进行调整。如果与行为实验相结合，在动物未进行测试的日子进行尾部出血。空气暴露的对照应按照与暴露于酒精蒸气的大鼠相匹配的时间表进行处理和放血。>
在室温下以9,500 x g >离心血液样品12分钟以从血液中分离血清。根据制造商的说明，使用重组的醇氧化酶/缓冲试剂，在Analox AM1分析仪上运行血清样品，以确定BAL。用于在运行血清样品之前校准Analox的乙醇标准品应尽可能接近预期的BAL范围。在我们的实验中，我们通过向50ml DI H 2 中加入62.5μl100％（v / v）乙醇制备100mg / dl标准品。应经常（至少每1-2周）准备标准溶液，以确保准确浓度。
注意：如果动物极度受损（> 例如> ，失去运动活动，失去肌肉张力，没有反应），这可能表明BALs极高（可以通过测量BAL来确认。如果该暴露水平不是研究的目的，应将动物从酒精蒸汽中过夜除去，以使BAL在下一次暴露开始前恢复到零。如果需要进一步干预，请咨询兽医人员（> 例如> ，如果大鼠出现脱水则给予盐水;如果不能吃固体食物则给液化食物;如果体温则放在加热垫上减少;如果存在严重的戒断症状[> 例如> ，癫痫发作]，则进行药物治疗。根据需要调整泵设置以减少BAL。如果无法使用Analox AM1分析仪，可以使用其他方法测量BAL，例如市售的酶测定和气相色谱 - 质谱。如果使用其他方法，请根据需要调整血液采集程序（> 例如> ，样品存储，离心机设置）。>＆nbsp;
在整个CIE期间监测大鼠。通过视觉观察行为，每天评估大鼠的一般健康状况和健康状况。每天检查食物和水量，必要时补充。在非测试日，每周更换一次床上用品。
注意：向笼子输送蒸汽通常不会导致潮湿的食物或床上用品;如果出现结露，将动物转移到干净，干燥的笼子中，并更换食物和床上用品。实验者可以使用期望的度量来评估戒断症状严重性。虽然在其他地方有更详细的描述（Majchrowicz，1975; Faingold，2008），但在退出期间出现的症状，如BAL接近0，可以是温和的（> 例如> ，一般多动症）更严重（> 例如> ，惊厥性癫痫发作）。在癫痫发作的情况下，动物可以用苯二氮卓类药物治疗或返回酒精蒸气以缓解症状。在开始实验之前，最好咨询您所在机构的兽医，制定干预计划。 >
＆NBSP;对大鼠通常代谢乙醇的速率的非常粗略的估计是大约25mg / dl / h。用于进入中毒或戒断阶段的测试或组织收集应相应地安排（> 即> ，当BAL达到峰值或等于零时）。例如，正在测试急性戒断效应的大鼠可能会维持在150-200 mg / dl的目标范围内，并在蒸汽关闭后6-8小时进行测试或处死。>
完成实验后，关闭蒸汽吸入系统。使用温和的清洁剂（例如>，Liquinox）清洁笼子，并让所有组件（笼子和空气/真空软管）完全干燥。

数据分析

数据分析通常基于实验的目的和使用的体内>和/或离体>程序而不同。如果将CIE与行为测试相结合，则应对大鼠进行测试，直至出现行为表型（例如，升级的酒精饮酒和痛觉过敏出现在几周; 例如>，Somkuwar 等。< / em>，2016）。实验目标将根据CIE的总持续时间以及相对于“蒸汽关闭”的测试或牺牲时间点来规定测试和终点时间表。在我们的实验中，大鼠在测试期间进行测试。急性停药期。大鼠应始终暴露，处理和与暴露于空气的对照平行测试，这允许对所测试的所有变量进行这两组的统计比较（例如>，单向或双向ANOVA;例如，参见Avegno et al。>，2018）。如果CIE用于制备用于分子生物学或电生理学实验的组织，则组织收获通常在≥4周的CIE后发生（时间= 0对应于第一阶段，其中大鼠表现出所需范围内的BAL）。相关分析可用于探索同一队列中动物体内体内>和/或体外>测量值与BALs之间的关系。
＆NBSP;在行为实验中，可以基于行为测定特异性的预定标准（例如>，未达到标准，或在异常值测试之后）排除大鼠。此外，实验者应该意识到极端酒精过度暴露（即>，极高的BALs）会产生神经毒性作用（例如>，Obernier 等。 >，2002）和/或永久改变行为。在整个实验过程中应监测每只大鼠的体重;体重减轻> 10％也可能是从分析中去除受试者的理由（咨询您的兽医和IACUC），因为这可能表明可能影响其他感兴趣变量的健康结果不佳。

笔记

如果需要，可以用呼气测醉装置监测空气 - 乙醇浓度。为了达到这个目的，人们只需要一个带螺帽的端口，可以将其移除以允许空气进入呼吸测醉器。该端口可由制造商插入，或由实验者插入自组装设备中。多个供应商提供呼吸测醉器。通常，在我们的实验室中，我们使用血液乙醇浓度（不是空气 - 乙醇浓度）作为设定变化的指南。表1中显示了在实验开始时具有4个鼠笼和被动排气的机器的样品设置。通常，这些设置太低而不能产生中毒，这是有意的，并且我们在数天内缓慢增加设置以产生中毒。对于具有4个以上鼠笼的机器或不同大小/年龄的动物，设置会有所不同。
＆NBSP;由于大鼠大小和乙醇代谢的差异，群体内BAL的个体差异可能发生。根据我们对Long-Evans和Wistar大鼠的经验，给定的队列通常将BAL保持在彼此50mg / dl范围内。偶尔会观察到相当大的差异，给定的大鼠显示BAL 100 mg / dL超出其他大鼠的范围。此外，在一些机器中，输送到每个笼子的酒精蒸汽浓度可能略有不同。减轻给定队列大鼠内个体差异的策略将取决于所用蒸汽机的类型。例如，如果使用通过单独和单独的线路向每个笼子输送酒精蒸汽的机器，实验者可以重新安置动物（即>，容纳具有类似低BAL笼状物的低BAL大鼠）和/或改变每个笼子的气流。这在将酒精蒸汽输送到所有动物所在的单个封闭空间的机器中是不可能的，但是这种类型的机器应该在较小的动物间变异性。空气流量的增量增加或减少（例如>，~3 p.s.i.）可分别使BAL略微减少或增加。只有在需要对个体BAL进行微小改变时才应考虑该策略，并且任何单个标准尺寸鼠笼的气流量不应低于10 p.s.i.通过改变酒精泵的设置，可以而且应该通过更加粗暴和彻底的BAL变化来实现。
＆NBSP;响应于相同的醇蒸气设置，大鼠菌株在中毒水平和代谢耐受性方面可能不同（例如>，Gilpin 等人>，2008）。年龄也是一个考虑因素;对于旨在关注成年期的实验，蒸气暴露应该不早于8周龄开始。蒸汽暴露可能发生在较早的时间点（例如>，在青春期），但这些数据的解释可能与成人实验数据不同，因为酒精对大脑和行为的影响在整个生命周期中发生变化（Novier et al。>，2015）。使用青少年大鼠的实验可能需要使用较低的泵设置来实现目标BAL，因为它们相对于成人的尺寸较小;然而，青春期大鼠表现出新陈代谢增加和对酒精镇静作用的敏感性降低（Little et al。>，1996）。性别也可能是一个重要的考虑因素，无论是体重（雌性大鼠体重较小）还是动情周期，如果这是给定实验的重要考虑因素。 CIE也可以用于不同的物种，包括小鼠，虽然设置和暴露时间表通常差别很大（例如>，Becker和Hale，1993; Griffin et al。>，2009 ）。

表1.一组8只雄性Wistar大鼠的初始泵设置和相应BAL的样本。请注意，在给定泵设置下输送到加热烧瓶的乙醇量对于每个蒸汽系统是不同的，并且给定蒸汽系统上的泵设置不是线性的（即>，泵设置的增量增加不一定转化为输送到系统的乙醇量的同等增量增加）。这强调了每次调整蒸汽系统时测量BAL的重要性。

致谢

该方案得到国立卫生研究院（NIH）授予的R01 AA023305（NWG），R01 AA026531（NWG），F32 AA025831（EMA）和V.A.的支持。授予I01 BX003451（NWG）。本文概述的方案改编自（Gilpin 等人，>，2008）。

利益争夺

NWG拥有Glauser Life Sciences，Inc。的股份，该公司是一家有兴趣开发精神疾病治疗药物的初创公司（与当前工作没有直接联系）。 EMA声明没有竞争性的经济利益。

伦理

所有程序均经路易斯安那州立大学健康科学中心的机构动物护理和使用委员会批准，并符合国家卫生研究院的指导方针。

参考

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