材料和试剂

移液器吸头
1. 1-10μl（Thermo Fisher，Finntip TM ，目录号：FNP4641040N）
2. 10-100μl（Thermo Fisher，Finntip TM ，目录号：FNP4641070N）
3. 100-1,000μl（Thermo Fisher，Finntip TM ，目录号：FNP4641100N）＆nbsp;
Desmosine（DES）（西格玛奥德里奇，目录号：D9439）
二羟基硒酸亮氨酸（DHLNL）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-207059）
Lysinonorleucine（LNL）（TRC-加拿大，目录号：L488750）
吡啶啉（PYR）（BOC Science，目录号：77464-35-8）
脱氧吡啶啉（DPYR）（BOC Science，目录号：83462-55-9）
羟基赖氨酸亮氨酸（HLNL）（在我们的实验室中纯化，参见Naffa et al。>，2019a）
组氨醇羟基硒酸亮氨酸（HHL）（在我们的实验室中纯化，参见Naffa et al。>，2019a）
组氨酸羟基甲基脯氨酸（HHMD）（在我们的实验室中纯化，参见Naffa et al。>，2019a）
质谱级水（Fisher Chemicals，目录号：FSBW5-4）
质谱级乙腈（Fisher Chemicals，目录号：FSBA955-4）
质谱级甲酸（Fisher Chemicals，目录号：FSBA117-50）
乙酸（UNIVAR，目录号：UN2789）
溶剂A（见食谱）
溶剂B（见食谱）

设备

自动进样器琥珀色样品瓶（32 mm x 11.6 mm）（Thermo Fisher，目录号：THC11090519）＆nbsp;
Vortex（Fisher Scientific，目录号：FB15012）
自动翅片管（Thermo Fisher，目录号：FNP4700850N）
带有Q-Exactive Orbitrap质谱仪的Thermo Fisher UHPLC，配备加热电喷雾电离（HESI）（Thermo Fisher，CA，USA）
注意：表1显示了设备4中仪器的所有规格。
>
表1. Q-Exactive质谱仪UHPLC的规格
Cogent Diamond Hydride HPLC柱150 mm x 2.1 mm;粒径，2.2μm;孔径100Å（Microsolv Technology，目录号：70200-15P-2）

软件

Thermo Xcalibur 4.1.31.9 2017年6月8日进行定性分析和定量分析（Thermo Fisher，CA，USA）

程序

如表2所示，通过连续稀释制备交联标准品。使用含有0.1％甲酸的水作为稀释剂，以μl计量所有体积，并将其转移到琥珀色自动进样器样品瓶中。
注意：>
1. 可以使用不同的体积，但必须使用相同的稀释因子。＆nbsp; >
2. 制备的交联标准品可在-20°C下保存长达一年，但是，总是制定一个新标准来检查冷冻浓度。>
3. PYR和DPYR可能会随着时间的推移而降解，并且它们的浓度会因暴露在光线下而发生变化，因此请始终使用琥珀色自动进样器样品瓶并将其存放在黑暗中。>
表2.用含0.1％甲酸的水稀释的交联聚乙烯的标准浓度

*体积以μl为单位测量。
** D.F。是稀释因子。
将自动进样器的温度设置为6°C，然后将样品瓶放入自动进样器中。
在金刚石氢化物柱上使用以下分离程序：
1. 流速0.3毫升/分钟。
  注意：也可以使用更高的流速（0.4-0.6 ml / min），这将更快地洗脱交联，但这可能会影响分辨率。>
2. 柱温25℃。
使用以下参数进行质谱分析：＆nbsp;
1. 正离子模式。
2. 质量扫描（100-700 m / z）。＆nbsp;
3. 喷涂电压3,300 V.＆nbsp;
4. 毛细管320°C。
5. 探头加热器的温度为350°C。
6. 氮气设定为10L / min的流速。
将进样体积设定为1.0μl。
注意：根据样品中的交联浓度，注射体积最多可调节至10.0μl。＆nbsp;
溶剂A是水，溶剂B是80％乙腈水溶液，均含有0.1％（v / v）甲酸（参见配方）。
使用梯度洗脱程序如下：
1. 时间：0.00，％A 20％，％B 80％。
2. 时间10.00，％A 60％和％B 40％。
3. 时间15.00，％A 90％和％B 10％。
4. 时间20.00，％A 20％和％B 80％。
使用10分钟的运行时间。
注意：您必须确保二元泵压力达到初始条件，这可能因UHPLC仪器的空隙体积而异，通常10分钟就足够了。>
标准品的典型分离色谱如图1和图2中标准品的分离色谱所示。＆nbsp;
每10-20次注射后，您必须注射一个空白（仅限水），具体取决于样品。此外，每100-150个样品必须用含有0.1％甲酸的50％甲醇水溶液洗涤柱子，流速为0.2 ml / min。

图1. LNL，HLNL，DHLNL，HHL，PYR，DPYR，DES和HHMD标准品的提取离子色谱图（EIC）。插图显示每种交联的提取质量范围。

图2.皮肤水解产物中LNL，HLNL，DHLNL，HHL，PYR，DPYR，DES和HHMD的提取离子色谱图（EIC）（用于制备生物样品水解产物，参见Naffa et al 。>，2016和Avery et al。>，2009了解更多细节）。插图显示了每个交联的提取质量范围。

数据分析

在Thermo Xcalibur 4.1.31.9上打开原始质谱文件进行定性分析。
提取下面的单同位素质量并观察±0.01 m / z。
1. LNL（276.19 m / z）。
2. HLNL（292.19 m / z）。
3. DHLNL（308.19 m / z）。
4. HHL（445.24 m / z）。
5. PYR（429.20 m / z）。
6. DPYR（413.20 m / z）。＆nbsp;
7. HHMD（574.33 m / z）。
8. DES（526.29 m / z）。
注意：>
1. 基于质谱的校准，质量可能存在微小差异。始终校准质谱仪以防止质量漂移（请仪器技术人员为您提供帮助，因为它需要特定的程序）。＆nbsp; >
2. 您可以从宽质量窗口（即292.1000-292.3000 m / z）开始，然后根据测量的质量细化窗口。＆nbsp; >
3. 您可以提取DES和HHMD的双电荷离子的质量，而不是它们具有更大强度的单电荷离子质量。（双电荷离子的质量通过在质量DES或HHMD上加上2.0然后除以2计算，即对于HHMD，双电荷质量为[573.33 + 2.0] / 2 = 287.66 m / z）。 >
使用峰面积和保留时间交联定量（Thermo Xcalibur 4.1.31.9 2017年6月8日使用Genesis算法进行定量分析，并对注入的样品进行自动测定）。
注意：对于生物样品的分析，交联的鉴定根据其质量和保留时间进行。这必须始终与交联标准一起运行。根据样品类型，运行次数，洗涤方案和色谱柱的使用年限，预计交联的保留时间会略有变化。>

食谱

溶剂A
为了制备溶剂A，测量1,000ml质谱级水，然后加入1.0ml（1,000μl）甲酸
溶剂B
制备溶剂B，混合800 ml质谱级乙腈和200 ml水，然后加入1.0 ml（1,000μl）甲酸

致谢

这项工作得到新西兰北帕默斯顿新西兰皮革和鞋研究协会（LASRA ®）的支持，通过商业，创新和就业部（MBIE）授权号LSRX1701＆amp; 1801.
该协议由Naffa 等人>（2016和2019b）改编和修改。

利益争夺

作者声明他们没有金融或非金融利益冲突。

参考

Arseni，L.，Lombardi，A。和Orioli，D。（2018）。从结构到表型：胶原蛋白改变对人类健康的影响。 Int J Mol Sci > 19（5）：e1407。
Avery，N.C。，Sims，T。J.和Bailey，A。J.（2009）。胶原蛋白交联的定量测定。方法Mol Biol > 522：103-121。
Gineyts，E.，Borel，O.，Chapurlat，R。和Garnero，P。（2010）。通过液相色谱 - 电喷雾电离质谱在结缔组织中定量未成熟和成熟的胶原交联。 J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci > 878（19）：1449-1454。
Naffa，R.，Edwards，P。J. B.和Norris，G。（2019a）。皮肤I型胶原交联的分离和表征：高分辨率NMR显示羟基硒酸亮氨酸交联的非对映异构体。氨基酸> 51（4）：705-715。
Naffa，R.，Holmes，G.，Ahn，M.，Harding，D。和Norris，G。（2016）。液相色谱 - 电喷雾电离质谱法，用于同时定量胶原蛋白和弹性蛋白交联。 J Chromatogr A > 1478：60-67。
Naffa，R.，Watanabe，S.，Zhang，W.，Maidment，C.，Singh，P.，Chamber，P.，Matyska，M。T.和Pesek，J.J。（2019b）。通过质谱和二氧化硅柱液相色谱法快速分析生物样品中的吡啶啉和脱氧吡啶啉。 J Sep Sci > 42（8）：1482-1488。
Pinnell，S.R.，Krane，S.M.，Kenzora，J.E。和Glimcher，M.J。（1972）。遗传性结缔组织疾病。羟基赖氨酸缺乏的胶原病。 N Engl J Med > 286（19）：1013-1020。