材料和试剂

用于土壤筛分的1毫米网眼尺寸（Fisherbrand tamis，France）
植物生长用塑料盆（7 x 7 x 6.4，黑盆，法国）
5 x 8 mm“超洁净”锡胶囊（Elemental Microanalysis，Okehampton，UK，目录号：D1034）
在钙质土壤的情况下：5 x 8 mm银胶囊（Elemental Microanalysis，Okehampton，UK，目录号：D2009）
植物生长的土壤和种子
用于建立该方案的土壤是luvisol，没有在LaCôteSaint-André（法国伊泽尔省）收集的氮源，并且用玉米连续收获。它是由16.2％的粘土，45.4％的壤土和28.4％的砂组成的壤土，总氮含量为1.9 g·kg -1
13 C测量的参考材料：IAEA-CH3（纤维素），IAEA-CH6（蔗糖）（Coplen et al。>，2006）和部分 13 C标记的材料[例如>，D-葡萄糖（3-13C，99％）]（Eurisotop，Saint-Aubin，France，目录号：CLM-1393-0.25）
用于碳（C）浓度测量的校准材料：天冬氨酸（Elemental Microanalysis，Okehampton，UK，目录号：B2042）
蒸馏水
液体N 2
纯 13 CO 2 （> 99％原子 13 C;购自Cortec Net，Paris，France）
在石灰质土壤的情况下：盐酸（HCl）37％（CAS号：7647-01-0，例如>，Sigma-Aldrich，Saint-Louis，MO，USA，目录号：30721- M）

设备

50毫升烧杯＆nbsp;
抹刀和镊子
干燥器（冷冻干燥器）（Alpha 1-4 LSC，Martin Christ ®，Osterode am Harz，德国）
搅拌机研磨机（Mixer Mill MM 200，Retsch ®，Haan，德国）＆nbsp;
分辨率为0.01 mg或更高的实验室天平（XP6微量天平，Mettler Toledo，Greifensee，瑞士）
同位素比质谱仪（Isoprime 100，Elementar UK Ltd.，Cheadle，UK），连续流动与元素分析仪（CN模式的vario PyroCube，Elementar Analysensysteme，Lagenselbold，Germany，或FlashEA 1112，ThermoElectron，Waltham，MA，美国）
生长室配备自动控制光照，温度，湿度，蒸发蒸腾，灌溉和CO 2 浓度

软件

Isoprime 100同位素比质谱仪操作软件：Ionopage ®用于Isoprime，构建1.6.1.0（Elementar Analysensysteme，Lagenselbold，德国）
元素分析仪操作软件（pyrocube Software v4.0.1用于此协议，Elementar Analysensysteme，Lagenselbold，德国）

程序

筛分土壤（1毫米筛目大小）并将其调整为每克干重0.17克水。然后，将170克干重放入盆中。每盆放一粒种子，每株植物重复6次，未种植土壤（散装土壤）重复6次。
将盆（每株重复6次，大块土壤重复6次）置于生长室中，根据研究的植物设置昼夜时期，光照强度和日常温度（Guyonnet et al。> ，2018b）。对于 Brasica napus >，拟南芥>， Triticum aestivum >， Medicago truncatula >和 Poaceae >植物例如，昼夜时间分别设定为8小时/ 16小时;光强为13.5 klux;每日最高温度范围为20至22°C。通过使用实验室天平称量盆并每2天加入蒸馏水来控制和调节土壤湿度（图1）。
种子播种三周后，根据Haichar 等，在活性光合作用过程中，每株植物和大块土壤注入纯的 13 CO 2 三次重复。> （2008和2012），为了在350μL -1 维持 13 CO 2 水平一周。在生长室中控制 12 CO 2 （土壤呼吸）和 13 CO 2 浓度。室中 13 C原子的同位素过量必须保持在> 1。在前10天期间80％且>之后90％。＆nbsp;
在没有 13 C标记的情况下培育其余的植物（每株重复3次）和大块土壤（未播种土壤重复3次），以确定 13 C天然丰度土壤和植物。
在标记结束时，通过摇动每株植物将根系与根粘附土壤（RAS）分离并收集粘附根的土壤。小心地将剩余的细根与RAS分离并立即将液体N 2 中的RAS冷冻，然后在-80°C下储存（图1）。＆nbsp;
在48小时内冷冻RAS并在测量 13 C富集之前使用混合研磨机研磨成细粉（~100μm粒度;目测验证是足够的）（图2A）。研磨步骤的持续时间应适应每种类型的土壤（在30赫兹下约1分钟;如果需要则重复，直至获得细粉）。

图1.植物生长，标记和收获以测量根分泌率
称取8 mg（调整目标质量以获得足够量的碳，通常>10μgC，取决于样品的C浓度和IRMS灵敏度）将冻干的RAS样品分成5 x 8 mm“超洁净”锡胶囊精确到0.01毫克（图2B）。
注意：在石灰质土壤中，无机碳（碳酸盐）会扭曲有机碳的测量结果。 13 > C测量有机碳。在这种情况下，通过酸熏蒸除去无机C.将土壤样品称重为银胶囊而不是锡。在每个胶囊中加入少量（50-150μl）蒸馏水以润湿土壤。将每个开口的胶囊放入干燥器中，用烧杯（37％）盐酸（HCl）在6至8小时内。在60°C下干燥。压下胶囊并将其放入新的锡胶囊中。>
使用镊子小心地将锡胶囊密封成立方体或球形（图2C）。
在优化源参数和根据良好实践校准后，通过EA-IRMS测量每个样品的 13 C / 12 C比率和C浓度（图2D）（例如>，Dunn和Carter，2018）。将样品与参考材料交叉，以便对数据进行标准化和质量控制。

图2.使用元素分析仪 - 同位素比质谱仪（EA-IRMS）测量 13 C / 12 C比值的土壤样品制备方案

数据分析

应用空白校正并将C浓度和 13 C / 12 C比率与参考和校准材料的测量值进行标准化（Coplen et al。> ，2006; Dunn和Carter，2018）。
通过IRMS测量C同位素组成为 13 C / 12 C比率，由仪器软件表示为δ 13 C in‰：< br />

δ 13 C = [（ 13 C / 12 C）样本 /（ 13 C / 12 C） PDB - 1] x 10 3
（ 13 C / 12 C）样品， 13 C / 12 土壤样品的C比（ 13 C / 12 C） PDB 是 13 C / 12 C比率的PDB（Pee Dee Belemnite，用于将δ 13 C量表固定在0‰的国际标准）并且等于0.0112372。
使用以下等式计算RAS中的 13 C浓度：

[ 13 C] = [C] x [（δ 13 C t - δ 13 C t-0 ） - （δ 13 C 对照 - δ 13 C control-0 ） ] x（ 13 C / 12 C） PDB / 10 3
哪里，
[ 13 C]估算土壤中渗出物的浓度或土壤中存在的微生物的同化物，以mg <1> C表示土壤重量（相当于干重），
[C]是土壤的碳浓度，单位为mg·kg -1 ，
δ 13 C t 是种植土壤中有机碳的C同位素组成， 13 C-标记，
δ 13 C t-0 是没有 13 C标记的种植土壤中有机碳的C同位素组成，
δ 13 C 对照是 13 C标记的大块土壤中有机碳的C同位素组成，
δ 13 C control-0 是大块土壤中有机碳的C同位素组成， 13 C-标记。
注：δ> 13 > C > t-0 > 和δ> 13 > C > control-0 > （即，没有> 13 > C-labeling）确定是为了考虑> 13 > C散装和种植土壤中的天然丰度。在大多数实验中，这些值将是相同的，因此可以从步骤3中的等式中删除。>

计算示例：
对于 Bromus erectus >种植 13 C-标记的土壤（δ 13 C t ），a <测量了根粘附土壤的含量为480.5‰的sup> 13 C。 13 C标记（δ 13 C 对照）的大块土壤δ 13 C为-5.5 ‰。没有 13 C标记，根系粘附土壤的δ 13 C（δ 13 C t-0 ）等于-22.5±0.3‰且大块土壤的δ 13 C（δ 13 C control-0 ）为 - 22.7±0.2‰。土壤的C浓度（[C]）为1.67±0.2％（16.7×10 3 mg·kg -1 ）。
＆NBSP;使用步骤3中的等式，测量土壤中渗出物浓度为91.2 mg 13 C·kg -1 （干重）。

致谢

测量根分泌物含量的方法在微生物生态学实验室与L. Simon博士联合开发并由Guyonnet 等人发表（>）（2018a）Ecology and Evolution DOI：10.1002 / ece.3.4383。我们感谢用于种植植物的“Serre et chambres climatiques”平台（UniversitéLyon1，FR BioEnviS），以及用于元素和同位素分析的“Ecologie Isotopique”平台（UniversitéLyon1，UMR 5023）。这项工作得到了法国国家研究机构（ANR-18-CE32-0005，DIORE）的支持。

利益争夺

宣布没有竞争利益。

参考

Coplen，T.B.，Brand，W.A.，Gehre，M.，Gröning，M.，Meijer，H.A.J.，Toman，B。和Verkouteren，R.M。（2006）。 δ 13 C测量的新指南。 Anal Chem > 78（7）：2439-2441。
Dunn，P。J. H.和Carter，J.F。（2018）。同位素比质谱的良好实践指南。在：Dunn PJH和Carter，JF（编辑）。第2版。
Guyonnet，J。P.，Cantarel，A。A. M.，Simon，L。和Haichar，F。e。 Z.（2018a）。根系分泌率是植物营养素使用策略分类中涉及的功能特性。 Ecol Evol > 8（16）：8573-8581。
Guyonnet，J.P.，Guillemet，M.，Dubost，A.，Simon，L.，Ortet，P.，Barakat，M.，Heulin，T.，Achouak，W。和Haichar，F.E。Z.（2018b）。植物营养资源利用策略通过根系分泌物形成活跃的根际微生物群。前Plant Sci > 9：1662-1662。
Haichar，F.Z.，Marol，C.，Berge，O.，Rangel-Castro，J。I.，Prosser，J.I.，Balesdent，J.，Heulin，T。和Achouak，W。（2008）。植物宿主栖息地和根系分泌物塑造土壤细菌群落结构。 Isme j > 2（12）：1221-1230。
Haichar，F。Z.，Roncato，M。A.和Achouak，W。（2012）。稳定同位素探测拟南芥根际细菌群落结构和基因表达>。 FEMS Microbiol Ecol > 81（2）：291-302。