材料和试剂

100-1,000μl移液器吸头（Sigma-Aldrich）
试管架（Sigma-Aldrich，目录号：Z334146）
螺帽管和盖帽（Sigma-Aldrich，目录号：AXYSCT10MLS）
Pyrex试管20 ml（Sigma-Aldrich，目录号：CLS980016）
紫外石英比色杯，半微量方形，1.4 ml，PTFE塞子（Sigma-Aldrich，目录号：Z276707）
孔径为0.2μm的无菌注射器过滤器（Fisher Scientific，目录号：720-1230）
带螺旋盖的离心管，容量10 ml（Sigma-Aldrich，目录号：SIAL301NN10R）
Pyrex玻璃血清移液器，容量5 ml（Sigma-Aldrich，目录号：Z653829）
琥珀色储存瓶（Sigma-Aldrich，Supelco，目录号：23230-U）
Klebsiella > SGM 81菌株（从 Dianthus caryophyllus >的根际分离）
蒸馏水
营养肉汤（微生物级）（Sigma-Aldrich，目录号：70122-500G），其成分和最终pH值见下文：
FeCl 3 试剂级（Sigma-Aldrich，CAS：7705-08-0）
高氯酸70％（Sigma-Aldrich，CAS：7601-90-3）
甲醇（实验室级）（Sigma-Aldrich，CAS：67-56-1）＆nbsp;
HCl（ACS级）（Sigma-Aldrich，CAS：7647-01-0）
L-色氨酸（traceCERT级）（Sigma-Aldrich，CAS：73-22-3）
醋酸冰醋酸（Sigma-Aldrich，CAS：64-19-7）
乙酸乙酯（无水级）（Sigma-Aldrich，CAS：141-78-6）＆nbsp;
吲哚-3-乙酸（IAA）（Sigma-Aldrich，CAS：87-51-4）
Murashige和Skoog培养基（Sigma-Aldrich）
乙腈
甲酸铵
CH <子> 3 CN
甲酸
乙醇
琼脂糖
文化媒体（见食谱）
Salkowski试剂（见食谱）

设备

抹刀（Thermo Fisher，目录号：F36711-0012）
Nichipet Eco移液器，体积100-1,000μl（Sigma-Aldrich，目录号：Z710199）
量筒（Sigma-Aldrich，目录号：Z324361-2EA）
250毫升锥形瓶（Sigma-Aldrich，目录号：Z723088-1EA）
旋转式真空闪蒸器（Buchhi型）（Jain Scientific Glass，1188）
平衡
Agilent 1100液相色谱系统和ABSciex 6500 Qtrap MS [色谱法在Phenomenex Luna C18色谱柱上（100 mm x 2 mm x3μm）]
紫外分光光度计（Systronics，166）
微量离心机（Thermo scientific，Pico 17）
磁力搅拌器（Remi，1 MLH）
Vortex环形混合器（Remi，CM 101）

软件

分析师1.6.1（AB Sciex）

程序

使用Salkowski试剂法从 Klebsiella > SGM 81进行IAA筛选和定量分析
1. 文化准备
  1. 取预培养基（不含色氨酸），并用单菌落的SGM 81菌株或该菌株的一系列甘油原液接种。
  2. 将接种的预培养基在30℃，120rpm下孵育过夜。这将导致 Klebsiella > SGM 81菌株的幼龄培养物，其可用于接种IAA生产培养基（测试培养基）。＆nbsp;
  3. 在测试培养基中加入100μl幼小培养物并涡旋以获得均匀的悬浮液。
  4. 在黑暗条件下（通过用报纸/铝箔包裹容器）在30°C，120rpm的摇动条件下孵育。＆nbsp;
  5. 孵育在黑暗条件下持续24-96小时，这取决于菌株的IAA生产能力。 Klebsiella > SGM 81产生IAA直至72小时，之后记录的产量减少。
2. 使用Salkowaski试剂进行吲哚定量分析
  1. 24小时后，取出1.5ml样品培养液并转移到Eppendorf管中。
  2. 使用微量离心机在16,278 离心5分钟离心5分钟。
  3. 小心取出1 ml上清液，转移到新的试管中。
  4. 混合等体积（1ml）的Salkowski试剂，轻轻涡旋并在30℃，黑暗条件下孵育反应30分钟。＆nbsp;
  5. 在新的试管中，用1ml对照未接种的培养基替换上清液，并与1ml Salkowski试剂混合。这是空白。
  6. 通过在30分钟后测量粉红色显色来检测IAA的存在（一些菌株可能产生红色，如图1所示）。
    
    图1.由Indole-Salkowski试剂反应引起的显色。 A. Klebsiella SGM81。 B. SGM09。 C.控制未接种的培养基。
  7. 使用未接种的培养基设置空白。用比色皿在536nm处用分光光度法测量颜色强度。
  8. 将测试样品的光密度与标准IAA曲线（10-100μg·ml -1 ）进行比较，以计算浓度。＆nbsp;
  9. 以相似的间隔重复该过程，直到光密度开始降低，表明没有进一步产生IAA。
用液相色谱 - 质谱（LC-MS / MS）分析IAA
1. 样品制备
  1. 在250ml Erlenmeyer烧瓶中制备100ml补充有0.5g L-色氨酸的营养肉汤培养基。
  2. 在测试培养基中加入100μl幼小培养物并涡旋以获得均匀的悬浮液。
  3. 将其在黑暗条件下（通过用报纸/铝箔包裹容器）在30℃下以120rpm的振荡条件孵育72小时。＆nbsp;
  4. 为了分离细胞，在4℃下以2,800×g离心20分钟，并收集1,000ml上清液。
  5. 将上清液转移到250ml螺旋盖玻璃瓶中。加入2-3滴1N浓HCl使其酸化至pH2.5-3。
  6. 为了提取IAA，将双倍体积的乙酸乙酯加入到酸化的上清液中并剧烈摇动5分钟（或者，可以使用分液漏斗）。让混合物在室温下静置10分钟，得到顶层乙酸乙酯。使用此图层进行进一步处理。＆nbsp;
  7. 在旋转蒸发器中，将水浴温度设定为乙酸乙酯的沸腾温度，即77.1℃（或者，乙酸乙酯相可在40℃的旋转蒸发器中真空干燥）。溶剂系统的干燥时间根据样品量而变化。＆nbsp;
  8. 将乙酸乙酯层转移到圆底烧瓶中并调节其旋转以避免液体样品的任何撞击。 “碰撞是化学中的现象，其中在试管或其他容器中沸腾的均质液体将超热，并且在成核时快速沸腾将液体从容器中排出（维基百科）” - 这将使IAA从烧瓶中逸出进入冷凝器管附有圆底烧瓶。
  9. 在液体乙酸乙酯完全蒸发后，将纯IAA留在附着于旋转烧瓶底部的结晶形式中。＆nbsp;
  10. 关闭旋转蒸发器的所有装置并取下圆底烧瓶。将结晶IAA重新溶解在5ml 20％甲醇中，并储存在-20℃以备将来使用。
2. LC-MS / MS分析
  1. 使用0.2μm的无菌注射器过滤器过滤储存的甲醇提取物（100μl），以分离不溶性颗粒和较大的化合物（如果有的话）。这是最终的分析样本。
  2. 将Phenomenex Luna C18（2）柱（100mm×2mm×3μm）在50℃的温度下用作色谱系统。
  3. 10％溶剂A（2％乙腈，10mM甲酸铵，pH 4.2）至90％溶剂B的梯度溶剂系统（94.9％CH 3 CN，5％H 2 O，0.1％甲酸）用于该柱。
  4. 用90％溶剂B洗涤柱子3分钟，然后用90％溶剂A重新平衡6分钟。＆nbsp;
  5. 使用10μl进样加载样品进行分析。
  6. MS配置了Turbo喷雾离子驱动源，其源温度设置为500°C，离子喷雾电压设置为5,500 V.＆nbsp;
  7. 使用176> 1的转变以正模式通过多反应监测（MRM）分析IAA。 130的碰撞能量为20eV。 176的转变> 130表示与前体和碎片离子相关的特定质荷比（m / z）值对。在我们的例子中，Q1设置为176 amu，Q3设置为130 amu，碰撞能量为20 mV。
  8. 将分离电位，退出电位和碰撞池出口电位分别设置为30 V，10 V和10 V.
原位> Salkowski染色
1. 准备Murashige和Skoog（MSM）基础盐培养基，含0.8％琼脂糖，不含植物激素补充剂。＆nbsp;
2. 对 D进行消毒。使用三步法制备caryophyllus种子：在70％乙醇中洗涤1分钟，然后在20％NaClO中洗涤4分钟，最后在无菌蒸馏水中漂洗3次。
3. 允许 D。通过在25℃下在14小时光照和10小时黑暗循环中将平板在植物培养室中孵育直至根长度达到2cm（大约6天），使caryophyllus >种子在MS培养基上发芽。＆nbsp;
4. 通过将根尖浸入5ml细菌悬浮液中处理萌发的植物根，通孔管中滴定10 5 CFU ml -1 。＆nbsp;
5. 将处理过的植物转移到方形培养皿（120mm×120mm×15mm）中的缺乏IAA和蔗糖的新MS琼脂培养基上。
6. 再次，在植物培养室中在25℃，14小时光照和10小时黑暗循环中孵育平板。
7. 感染两周后，用Salkowski试剂对处理过的根进行染色。＆nbsp;
8. 为了染色根部，在每个根部添加400μlSalkowski试剂并观察任何可见的颜色变化。＆nbsp;
9. 粉红色的发展如下图所示，表明根部和周围存在近端IAA（图2）。
  
  图2.用克雷伯氏菌SGM 81处理的植物根部的原位Salkowski染色105 CFU ml-1滴度

数据分析

取样品的光密度为536nm，并根据标准曲线图形计算IAA的浓度。来自 Klebsiella > SGM 81菌株的IAA估计，使用Salkowski试剂显示在72小时后用0.15％色氨酸检测到最大产量至215μg·ml -1 （图1a中的Gang et al。>，2018）。
对于LC-MS / MS分析，通过增强产品离子扫描确认样品中的特性。＆nbsp;
使用Analyst 1.6.1（AB Sciex）完成数据采集和分析。＆nbsp;
通过将测试样品数据与对照标准IAA进行比较来进行定量。
在商业IAA标准品和样品上清液之间LC（5.90分钟和5.92分钟）和相同的m / z比（130.1）之间的重叠保留时间显示 Klebsiella > SGM 81产生大量（960μg·ml < 72小时后均相IAA（Gang et al。>，2018），sup> -1 。
在Salkowski处理的根上发展粉红色表明在根部附近存在细菌IAA（Gang 3a等图3a，2018）。

笔记

本文讨论的Salkowski试剂方法使用营养肉汤液体培养基（补充有L-色氨酸）显示，该培养基是大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的非特异性液体培养基。然而，如果分别从根瘤菌或磷酸盐溶解细菌进行IAA生产和定量，则可以使用其他培养基如酵母提取物甘露醇（YEM），Pikovskaya肉汤（补充有L-色氨酸）。＆nbsp;
预培养制剂对于初始细胞计数的标准化是重要的，尤其是当针对优化过程进行IAA定量的比较研究时。
Salkowski试剂方法量化样品中存在的总吲哚。为了获得吲哚-3-乙酸（IAA）的纯度和结合物，可以使用其他分析方法，如HPLC，LC-MS / MS，HPTLC 等。>。

食谱

文化媒体
1. 使用量筒，测量100毫升蒸馏水，并将其转移到250毫升锥形瓶或螺旋盖玻璃瓶中。使用和不使用色氨酸的相同培养基的另外两个烧瓶将分别用作对照和预培养基（用于激活SGM 81培养物以产生幼培养物）。
2. 对于简单的液体营养肉汤培养基，称取1.3克营养肉汤，并将其溶于100毫升蒸馏水中。适当搅拌，使粉末在蒸馏水中适当混合
3. 称取0.15g L-色氨酸（0.15％w / v）并加入到制备的营养肉汤烧瓶中。这是含有色氨酸补充剂的液体营养肉汤
4. 将制备的培养基在121℃下高压灭菌15分钟
5. 在接种前让培养基冷却并达到室温，以确保接种物的存活
Salkowski试剂
1. 0.5毫升100毫升氯化铁（溶解8.125克FeCl 3 在100毫升蒸馏水中）
2. 为了稀释容易得到的高氯酸，在量筒中测量24.5ml（v / v）蒸馏水，并向其中加入24.5ml（v / v）浓酸。
3. 将1ml（v / v）0.5M氯化铁溶液加入49ml 35％高氯酸中
4. 在室温下充分混合并储存在深棕色瓶中。如果在所述条件下储存，它可用于进一步的实验

致谢

我们感谢印度科学和技术部在2014 - 15年INSPIRE奖学金（IF 140042）下提供的财政援助。这项工作也得到了英国BBSRC（BB / 003608/1）的支持。在伦敦帝国理工学院，我们感谢Mark Bennett帮助进行LC-MS / MS分析。该协议改编自Gang 等人>（2018）。

利益争夺

我们声明没有利益冲突。

参考

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Gang，S.，Saraf，M.，Waite，C.J。，Buck，M。和Schumacher，J。（2018）。 Klebsiella > SGM 81与 Dianthus之间的相互关系caryophyllus >调节根系可塑性和根际细菌密度。植物土壤> 424：273-288。＆nbsp;
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