材料和试剂

物料

移液器吸头（Fisher，目录号：02-707-426,02-707-403,02-707-438）
1.5 ml微量离心管（STARLAB，目录号：51615-5500）
T175组织培养瓶（TPP ®组织培养瓶，Sigma，目录号：Z707562）
12孔聚苯乙烯培养板（TPP ®组织培养板，Sigma，目录号：Z707775）

病毒
艾柯病毒7（EV7），源自EV7感染性克隆
注意：Echovirus 7菌株Wallace的cDNA来自Michael Lindberg（GenBank登录号AF465516，沉默取代 1687 G-to-A）并克隆到T7 RNA启动子的下游。突变病毒EV7-Loop和EV7-PTC通过原始EV7感染性克隆的诱变产生，并且完全按重量EV7制备（Lulla 等，2019）。

细胞系
RD细胞（人横纹肌肉瘤细胞系，ATCC，CCL-136），通过新一代测序证实无支原体

试剂

Dulbecco的改良Eagle's培养基（DMEM）（Sigma，目录号：D6546）
胎牛血清（FBS）（PAN Biotech，目录号：P40-37500）
青霉素 - 链霉素（10,000 U / ml）（Life Technologies，目录号：15140-122）
200 mM L-谷氨酰胺（Gibco，目录号：25030081）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，目录号：14190-144）
1 M HEPES缓冲液，pH范围：7.2-7.5（Life Technologies，目录号：15630-080）
0.25％胰蛋白酶（Gibco，目录号：15090046-100）
牛血清白蛋白（BSA）（PAN Biotech，目录号：P06-1395500）
Direct-zol TM RNA MiniPrep Plus（Zymo Research，目录号：R2072）＆nbsp;
Phusion TM RT-PCR试剂盒（Thermo Scientific，目录号：F-546S）
完整的DMEM（见食谱）
无血清DMEM（见食谱）

设备

-80°C冰箱
涡流混合器
移液管：1000μl，200μl，20μl，2μl
CO ₂培养箱
血球
BSL2细胞培养柜
摇摆平台振动筛
相位倒置显微镜（尼康TMS）
4°C冰箱
高压灭菌器

软件

BioEdit（免费软件，Ibis Therapeutics， http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit /bioedit.html ）

程序

重要注意事项：所有病毒实验（即所有前Trizol RNA分离步骤）均应在生物安全2级（BSL2）组织培养实验室内根据国家和机构法规进行，并且需要有关肠道病毒株处理的许可证。存储。

感染和病毒传代
1. 在前一天通过在12孔板上每孔接种3×10 5 RD细胞来制备感染细胞（目的是每孔达到5×10 5 RD细胞。到第二天，这对应于亚汇合的RD单分子层）。
  1. 将RD细胞接种在T175烧瓶上并在完全DMEM中生长直至80-90％汇合。从细胞中吸出培养基并用10ml PBS冲洗。通过轻轻敲击烧瓶，使用3ml 0.25％胰蛋白酶胰蛋白酶消化RD细胞。
  2. 一旦细胞分离，加入10毫升完全DMEM，确保通过上下移液正确重悬细胞。使用血细胞计数器计数悬浮细胞。
  3. 用完全DMEM稀释细胞悬浮液，得到相当于每1ml 3×10 5个细胞的浓度。将1ml细胞悬浮液接种到12孔板的每个孔中。
  4. 在37℃，5％CO ₂培养箱中孵育过夜。
2. 使用显微镜检查细胞单层（相同的健康细胞单层，无CPE）。从细胞单层中除去培养基，并在0.2ml无血清DMEM中以0.1的总感染复数（MOI）感染。使用以下公式计算所需的病毒量：
  
  示例：对于10 9 PFU / ml病毒库存使用，5 x 10 5 细胞x 0.1 PFU /细胞x 10 3 μl/ ml / 10 9 PFU / ml =0.05μl。
3. 使用wt EV7和突变体以相等或1：9的比例混合，总MOI为0.1。
  注意：此测定可以与其他病毒和细胞系一起完成。取决于病毒生长动力学和细胞对感染的易感性，不同比例和MOI可用于该实验。使用MOI 0.1意味着超过90％的细胞保持未感染，为竞争病毒提供足够的空间;任何增长差异也应累积在传代上。＆nbsp;
4. 每次感染使用一式三份，阳性对照单次感染和模拟（未感染）细胞作为阴性对照，如图1所示。
  
  图1.以相等（左）或1：9（右）比例的两个12孔板的样品布局。每个后续通道都在类似的12孔板上进行。
5. 将感染的细胞在室温下在轻轻摇动的平台上孵育1小时。为了去除未结合的病毒，吸出感染培养基，用1ml无血清DMEM洗涤每个孔，并用0.5ml无血清DMEM覆盖细胞。
6. 在37℃下在CO ₂培养箱中孵育过夜（16-20小时）直至观察到完全CPE。
7. 将感染的培养板中的培养基收集到1.5ml管中，以9,600 x g 离心5分钟，然后转移到新的1.5ml管中并测量体积。
8. 向上清液中加入0.2％BSA（每0.5ml澄清上清液10μl10％BSA）。
9. 使用1：10,000体积的获得的病毒原种（对应于MOI 0.05-0.2）进行5次盲传（具有估计但未知的滴度）。使用与以前相同的感染协议（步骤1-8）。
  注意：为了低效复制病毒，可能需要超过5次传代。
10. 将病毒储存在-80°C。
11. 向剩余的细胞中加入1ml PBS，并通过移液到1.5ml管中收集它们（感染的细胞容易分离并且不需要刮擦）。在9,600 x g 离心细胞5分钟，去除上清液并从感染细胞中进行RNA分离。
从感染细胞中分离RNA
1. 根据制造商的方案使用Direct-zol TM RNA MiniPrep Plus（Zymo Research）从第1代和第5代分离RNA（ Direct-zol TM RNA MiniPrep Plus INSTRUCTION MANUAL ver.1.10.1 ）。
2. 使用Thermo Scientific TM Phusion TM RT-PCR试剂盒，使用病毒特异性引物和制造商的建议进行RT-PCR（ Thermo Scientific Phusion RT-PCR Kit手册）。引入的突变和测序引物的示例设计如图2所示。
  
  图2.突变病毒基因组和测序引物的示例设计。根据测序设施，300-1000 bp长PCR片段应该是此测定的最佳选择。
3. 对含有病毒基因组突变区域的PCR片段进行Sanger测序。
  注意：请考虑病毒的性质（细胞内或芽生病毒粒子）选择正确的样本进行分析。有时可以考虑从培养基而不是从感染细胞中分析RNA。肠道病毒不是关键步骤;因此，选择了一种更容易的方法（从感染细胞中分离RNA）。

数据分析

比较色谱图并根据每个分析样品的三种RT-PCR产物进行评估（图3）。在测试的实验条件下，病毒的生长特性没有差异。如果病毒的生长特性不同，色谱图应该会发生变化。比较每个样品的至少三个不同色谱图的峰面积并估算变化。如果wt病毒与突变体竞争，则第五代样本的色谱图应与wt病毒色谱图匹配。

图3.用于竞争的RT-PCR产物的样品测序色谱图。 EV7，EV7-PTC和EV7-Loop突变体在初始感染（P1）和五次传代后的实验（P5）。该图从Lulla 等人的补充图3中再现（2019）。

食谱

完成DMEM
500毫升DMEM
50毫升FBS
5毫升200毫摩尔L-谷氨酰胺
5毫升青霉素 - 链霉素（10,000 U / ml）
10毫升1M HEPES pH 7.2-7.5
储存在4°C
无血清DMEM
500毫升DMEM
5毫升200毫摩尔L-谷氨酰胺
5毫升青霉素 - 链霉素（10,000 U / ml）
10毫升1M HEPES，pH 7.2-7.5
储存在4°C

致谢

这项工作得到了Wellcome Trust拨款[106207]和欧洲研究理事会授予[646891] A.E.F.的支持。 Echovirus 7菌株Wallace的cDNA来自Michael Lindberg。我们感谢Hazel Stewart对协议的批判性阅读。

利益争夺

作者声明他们没有任何利益冲突或竞争利益。

参考

Lulla，V.，Dinan，AM，Hosmillo，M.，Chaudhry，Y.，Sherry，L.，Irigoyen，N.，Nayak，KM，Stonehouse，NJ，Zilbauer，M.，Goodfellow，I。和Firth，AE（2019）。肠道病毒的上游蛋白质编码区调节肠道上皮细胞中的病毒感染。 Nat Microbiol 4（2）：280-292。