材料和试剂

10毫升硼硅酸盐玻璃管（ISOLAB，目录号：077.02.003）
14毫升无菌管（SPL Lifescience，目录号：40014）
过滤器（PALL Lifesciences，目录号：AP-4219）
菌株 P.丁香科 pv。 phaseolicola 1448A（ Psph ）（Xiao et al。，2007）和 rhpS 缺失突变体（Δ rhpS ）（谢等人，2019）
NaOH（UNI-CHEM，目录号：1310-73-2）＆nbsp;
MgSO ₄·7H ₂ O（阿拉丁，目录号：10025-84-0）
K ₂ HPO ₄（阿拉丁，目录号：7758-11-4）＆nbsp;
Bacto TM 蛋白胨第3号（AOBOX，目录号：01-049）
利福平（阿拉丁，目录号：13292-46-1）
琼脂（MP Biomedicals，目录号：9002-18-0）
水晶紫（北京定国，目录号：548-62-9）
甘油（北京百灵威，目录号：262536）
100％乙醇（霍尼韦尔，目录号：32221-2.5L）
King's B（KB）（见食谱）

设备

1毫升移液器（Eppendorf，目录号：3123000063）
台式振动培养箱（Labwit Scientific，型号：ZWYR-240）
恒温培养箱（Labwit Scientific，型号：ZXDP-B2120）＆nbsp;
Evolution TM 350紫外 - 可见分光光度计（赛默飞世尔科技，目录号：912A0959）
Synergy TM 2多功能微孔板读板机（BioTek）
试管架（ISOLAB，目录号：079.01.005）
-80°C冰箱（Thermo Scientific，目录号：5IDTSX）

软件

Microsoft Office Excel 2016和GraphPad Prism 8.0.2。

程序

注意：

选择野生型 P. syringae pv。 phaseolicola 1448A（ Psph ）作为模型菌株（Xiao 等，2007）和 rhpS 缺失突变体（Δ rhpS ）（Xie 等。，2019）作为试验菌株。
执行图1中描述的分步协议。
轻轻地执行整个过程以避免损坏生物膜。
根据香港城市大学的安全规定，由经过培训的员工将液晶紫和乙醇废液收集在特别贴有标签的容器中进行专业处理。

图1.可视化的示意性逐步协议 P.丁香科生物膜形成。 A. Psph 菌株在King's B（KB）平板上被激活并在液体培养基中培养。 B.然后将培养物以1：500稀释度接种到KB液体培养基中并静态孵育至取样点。 C.然后用0.1％结晶紫染色生物膜。 D.测量OD _590nm处的生物膜产量。显示了两个生物学重复。

细菌生长
1. 从在-80℃冷冻的甘油储备培养物中收集 Psph 菌落，并接种在补充有利福平（25μg/ ml）的King's B（KB）平板上。将KB板在28℃下在恒温培养箱中孵育36小时。
2. 从培养的平板中收集单个菌落，并接种到含有2ml KB液体培养基的无菌10ml管中，所述液体培养基补充有利福平（25μg/ ml）。将试管在台式振荡培养箱中于28℃孵育12小时，并以220rpm持续摇动。
生物膜形成
将 Psph 培养物（1：500稀释液）接种到含有2ml KB液体培养基（补充有利福平）的16个无菌10ml硼硅酸盐玻璃管中，并确保一致的初始剂量。将含有 Psph 的玻璃管在28°C的恒温培养箱中孵育，不要摇晃。
生物膜可视化
1. 在不同时间点收获生物膜样品。对于我们研究中的 Psph ，在24,48,72和96小时收获生物膜。用1ml移液管轻轻丢弃浮游细胞，并用无菌蒸馏水洗涤管三次。避免损坏管壁上形成的生物膜。
2. 用2.5ml 0.1％结晶紫染色形成生物膜的细菌20分钟而不摇动。丢弃染料并用无菌蒸馏水洗涤管以除去未结合的染料。干燥管并拍照（图2A）。
生物膜测量
1. 用2ml 100％乙醇洗脱生物膜，并以220rpm摇动管20分钟以确保染料完全溶解。拍照（图2B）。
2. 使用分光光度计（2ml）或Synergy 2 Plate Reader（BioTek）（100μl）在OD _590nm处测量洗脱的样品。如果样品浓度过高，请在测量前将其稀释。使用等体积的95％-100％乙醇作为空白对照。 Psph 生物膜形成如图2C所示。与 Psph 野生型菌株相比，Δ rhpS 产生较低的生物膜（图3）。
  
  图2. Psph 野生型菌株中生物膜的可视化和定量。 A.生物膜样品生长24至96小时。在不同时间点粘附到硼硅酸盐玻璃管上的生物膜用结晶紫染色。 B.用乙醇洗脱与管壁上的生物膜结合的结晶紫。 C.通过使用分光光度计或Synergy 2 Plate Reader（BioTek）在OD _590nm下测量洗脱样品。 Psph 野生型菌株在96小时后产生更多的生物膜，而不是24小时。 *代表 P -value＆lt; 0.05。 ***表示 P - 值＆lt; 0.001。误差棒表示S.D.四个生物学重复。显示了两个生物学重复。
  
  图3.Δ rhpS 菌株比 Psph 野生型菌株产生更少的生物膜。 A. 生成的生物膜使用硼硅酸盐玻璃管观察Psph 野生型和Δ rhpS 菌株，并在96小时用结晶紫染色。 B.用乙醇洗脱与管壁上的生物膜结合的结晶紫。 C. Psph 野生型菌株比Δ rhpS 菌株产生更多的生物膜（ P - 值= 0.000136）。 ***表示 P - 值＆lt; 0.001。误差棒表示S.D.四个生物学重复。显示了两个生物学重复。

数据分析

使用Microsoft Office Excel 2016进行学生的 t - 测试。从图和表中的四个生物学重复中收集定量数据（OD _590nm）（表1和2）。

表1.生物膜产生 Psph 野生型菌株如图2C所示。双样本等方差为由Excel = TTEST（array1，array2，tails，type）中的以下单尾学生 t - 测试公式计算得出。数组1是第一个数据集。数组2是第二个数据集。尾部显示分布尾部的数量（单尾分布为1，双尾分布为2）。类型是要执行的 t - 测试类型（1对于配对，2对于双样本等方差，3对于双样本不等方差。例如，我们使用TTEST（B2：E2， B3：E3,1,2），TTEST（B2：E2，B4：E4,1,2）和TTEST（B2：E2，B5：E5,1,2）在48小时，72小时，96小时生物膜生产与24小时相比， P - 值分别在Excel H3，H4和H5中显示。*代表 P - 值<0.05。**代表 P - 值<0.01。***代表 P - 值<0.001。平均值和SD显示在F和G列中。所有实验重复四次。 />

表2.生物膜产生 Psph 野生型和Δ rhpS 应变如图3C所示。双样本等方差由Excel = TTEST中的以下双尾学生 t - 测试公式计算得出（ B2：E2，B3：E3,2,2）。 P - 值显示在第H3列中。 *代表 P -value＆lt;＆nbsp; 0.05。 **代表 P - 值＆lt; 0.01。 ***表示 P - 值<0.001。手段和S.D.列F和G显示。所有实验重复四次。

总之，结果表明，野生型 Psph 菌株在48 h内产生更多的生物膜（ P <0.05），72 h（ P <0.001）和96小时（ P <0.001）比24小时（图2和表1）。此外，Δ rhpS 菌株在同一时间点（96 h）产生的生物膜比 Psph 野生型菌株（ P <0.001）少。）（图3和表2）。

食谱

King's B（KB）（King et al。，1954）Bacto TM 蛋白胨第3号
20.0克/升
K ₂ HPO ₄
1.5克/升
甘油
15毫升/升溶于993.75ml ddH ₂ O并调节pH至7.2。加入15 g / L琼脂用于固化培养基和高压灭菌器将24.637g MgSO 4 ·7H ₂ O溶解在100ml ddH ₂ O中，并使用无菌过滤器（0.45）对该储备溶液（1M）进行灭菌。 μm）
然后，当温度降至40°时，将6.25 ml MgSO 4 ·7H ₂ O（1M）（终浓度1.5 g / L）加入高压灭菌的King's B培养基中C-50°C

致谢

该项目由卫生医学研究基金资助[17160022至X.D.];国家自然科学基金资助项目[31670127至X.D.]。
＆NBSP;该方案改编自O'Toole 等。（1998）Flagellar和抽搐运动是铜绿假单胞菌生物膜发育所必需的。 Molecular Microbiology ，30：295-304。

利益争夺

利益冲突声明：未声明。

参考
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