材料和试剂

NaH 2 PO 4 sub
EDTA
DTT
Tris
NaCl
甘氨酸
乙二醇
HCl
QAE琼脂糖柱起始缓冲液（见配方）
QAE Sepharose柱洗脱缓冲液（见配方）
缓冲液A（参见配方）
缓冲液B（参见配方）
缓冲区C（参见配方）

设备

高效液相色谱（HPLC）系统（Millenium V2.00，Waters，USA）
SDS-PAGE（Mini-PROTEAN Tetra Cell，目录号：165-8000）
苯基琼脂糖HP柱（3.5×1cm）（GE Healthcare，目录号：17-1082-01）
QAE琼脂糖柱（Amersham Pharmacia - 阴离子交换层析）。

程序

30 kDa抗原的纯化：
分枝杆菌的分泌的抗原85复合物由三种蛋白质Ag 85A，B和C组成。其中这些抗原85B或称为30kDa抗原是主要免疫原性抗原之一。
通过首先通过QAE柱，随后使30kDa富集的级分通过苯基琼脂糖疏水相互作用柱，从结核分枝杆菌的全部培养物滤液中纯化30kDa抗原。
1. 阴离子交换色谱-QAE琼脂糖（纯化Ag85复合物）
  （纯度85复合）
  1. 通过通过QAE Sepharose的预填充阴离子交换柱将在38kDa抗原纯化方案（在此Hyperlink）中提及的10至30mg的培养物滤液抗原（CFA）分离成多个级分。使用0.05M Tris-HCl缓冲液（pH 8.1）作为起始缓冲液，使用0.05M Tris-HCl，pH 8.1，用1.0M氯化钠作为洗脱缓冲液。在标准运行条件下在高效液相色谱（HPLC，Millenium V2.00，Waters，USA）系统中进行分离。在12.5％SDS-PAGE上分析洗脱的级分，其在标准条件（120V，1.5A）下运行基于其分子量分离蛋白质。 Ag85复合物被鉴定为凝胶上的30/31kDa双峰带。合并含有抗原85复合物的级分，并通过分子量截止为3kDa的Amicon离心过滤器浓缩。
  2. 通过使其通过疏水作用层析（HIC）柱（即Phenyl Sepharose HP柱），进行来自抗原85复合物的A，B和C组分的进一步纯化。
2. 疏水相互作用层析 - 苯基琼脂糖（分离抗原85复合物的单个组分）
  1. 将抗原85复合物纯化成其各个组分Ag 85A; 85B和85C通过使用生物色谱系统（FPLC，Bio-Rad，USA）使其通过Phenyl Sepharose HP柱来进行。运行期间使用三种不同的缓冲液。使用的缓冲区A，B，C在配方部分下提及
  2. 运行条件是使柱经受缓冲液A的等度流动10分钟（流速1ml/min），然后注入样品（2ml），其以缓冲液A的速率 0.5ml/min。然后使用以1ml/min的速率的缓冲液B的等度流动10分钟来洗涤未结合的物质。
  3. 抗原85复合物（即Ag85A，B和C）的各个组分的洗脱用缓冲液C的线性梯度（从0-100％）进行30分钟，流速为1ml/min。随后，通过在分光光度计上在280nm测量的光密度鉴定含蛋白质的级分。合并含Ag 85B的级分，浓缩并在12.5％SDS PAGE上检查纯度。

食谱

QAE Sepharose色谱柱起始缓冲液
0.05M Tris-HCl（pH8.1）
QAE Sepharose色谱柱洗脱缓冲液
0.05M Tris-HCl（pH8.1） 1 M NaCl
缓冲区A
0.01M NaH 2 PO 4 sub/
1mM DTT（pH 6.8）
缓冲区B
0.01 M Tris
100 mM甘氨酸 1mM EDTA
1mM OTT（pH8.9）
缓冲区C
0.01 M Tris
100 mM甘氨酸 1 mM DTT
50％（v/v）乙二醇（pH8.9）

致谢

该方案从Devi等人的原始出版物中提取（（2002）。这项工作得到了Indo US VAP& DBT印度授予Dr. Alamelu Raja博士。

参考文献

Devi，K.R.，Kumar，K.S.，Ramalingam，B。和Alamelu，R。（2002）。分枝杆菌的三种免疫显性蛋白（38,30和16 kDa）的纯化和表征肺结核。 Protein Expr Purif 24（2）：188-195。
Raja，A.，Uma Devi，KR，Ramalingam，B.and Brennan，PJ（2004）。通过检测游离和免疫复合物结合的抗30kDa抗体来改善肺结核的诊断。 Diagn Microbiol Infect Dis 50（4）：253-259。