材料和试剂

移液器吸头
XFe96传感器盒和组织培养微孔板（Agilent Technologies，Seahorse Bioscience，目录号：101085-004）
50毫升离心管（Greiner Bio-One，目录号：210261）
Parafilm（Bemis，目录号：HS234526C）
℃。线虫 N2布里斯托尔（Caenorhabditis遗传中心）
OP50-1 E.大肠杆菌细菌（Caenorhabditis遗传中心）
百草枯（Sigma-Aldrich，目录号：36541）
羰基氰4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）（西格玛奥德里奇，目录号：C2920）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：C2002）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）＆nbsp;
XF校准物（Agilent Technologies，Seahorse Bioscience，目录号：100840-000）
XFe96细胞外通量检测试剂盒（Agilent Technologies，Seahorse Bioscience，目录号：101085-004）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
Bacto琼脂（BD Biosciences，目录号：214010）
细菌蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：91249）
MgSO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：M2643）
CaCl ₂（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S9137）
K ₂ HPO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
KH ₂ PO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
Na ₂ HPO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
线虫生长培养基（NGM）琼脂（见食谱）
M9缓冲液（见食谱）
用于蠕虫同步的次氯酸盐溶液（见食谱）
1 M KPO ₄（见食谱）

设备

细胞外通量分析仪（Agilent Technologies，Seahorse Bioscience，型号：XFe96）
非CO ₂培养箱（Aqualytic，型号：TC445S）

软件

Seahorse Wave控制器软件（Agilent Technologies，Seahorse Bioscience）＆nbsp;
Prism 8（GraphPad软件， www.graphpad.com ）

程序

线虫种群同步（第0天）＆nbsp;
1. 使用标准次氯酸盐法（Stiernagle，2006）使一盘年轻成虫线虫与卵（约500只动物）同步。
线虫种群的增长（第1天至第3天）
1. 在20°C培养箱中维持一个94 mm NGM琼脂平板上约500只幼虫的同步组群，直到它们到达成年期（同步的野生型L1动物将在20°C下约50小时达到幼年期）。＆nbsp;
2. 将幼年线虫转移到百草枯处理板的前一天，通过在55℃下向无菌NGM琼脂中加入百草枯，预先制备10mM百草枯处理板，并将NGM琼脂倒入94mm板中，然后将琼脂放入琼脂中。固化。将 OP50-1 与百草枯混合，将NGM琼脂平板接种，干燥细菌并将平板保持在4°C。
百草枯治疗（第3天）
1. 将一半的年轻人（约250只线虫）转移到百草枯处理板上。
选择蠕虫进行检测（第4天）＆nbsp;
1. 从控制和处理板中挑选成虫用于氧气测量。
线粒体代谢通量测量
水合XFe96传感器盒（第3天）：
1. 将20毫升Seahorse XF Calibrant分装到50毫升离心管中。＆nbsp;
2. 将含有20 ml Seahorse XF校准物的离心管放入非CO ₂ 37°C培养箱中。＆nbsp;
3. 为XFe96细胞外通量检测试剂盒的传感器盒水合（参见图1A）
  1. 从实用板上取下传感器盒，将传感器盒倒置，确保传感器不与实验台的表面接触。＆nbsp;
  2. 在实用板的每个孔中加入200μl无菌水。
  3. 将传感器盒放在实用板上，将传感器浸入水中。＆nbsp;
  4. 将装配好的传感器盒和实用板放在37℃的非CO ₂培养箱中过夜。如果传感器盒正在水合超过24小时，请在其周围包裹封口膜以防止蒸发。水合传感器盒只能保持72小时。＆nbsp;
4. 打开XFe96控制器（计算机），XFe96分析仪并启动波形控制器软件。确保仪器的加热器已关闭，让机器在室温或较低温度下稳定过夜。
  
  图1.海马XFe96传感器盒。（A）顶部绿色板是传感器盒，底部透明板是实用板。（B）要装入化合物，将化合物装载导板放在浸没在装有XF校准物的实用板中的传感器盒顶部。将化合物直接吸移到化合物装载导板的所需柱中，以将化合物装入传感器盒中。装入进样口B或C时，切换到B / C装载导板。
分析日（第4天）
1. 水合XFe96传感器盒（从第3天开始）
  1. 从培养箱中取出装好的传感器盒和含有20 ml等分XF Calibrant的试管。＆nbsp;
  2. 丢弃实用板上的水。
  3. 将200μl过夜的每次温热的XF Calibrant加入实用板的每个孔中。＆nbsp;
  4. 将传感器盒放在实用板上，将传感器浸入水中。＆nbsp;
  5. 将装配好的传感器盒和实用板放回非CO ₂ 37°C培养箱中45分钟。
2. 制备药物并将药物装入传感器盒注射口
  1. 在45分钟的孵育时间内，制备羰基氰化物对 - （三氟甲氧基）苯腙（FCCP）和叠氮化钠，将其装入药物端口。如Fong 等（2017）所述，FCCP和叠氮化钠浓度已经过优化。＆nbsp;
  2. 在100％DMSO中制备2.5mM FCCP储备液。
    1. 在M9缓冲液中制备500μlFCCP稀释液至90μM。＆nbsp;
    2. 有关FCCP原料浓度和稀释度，请参阅表1。
      
      表1. FCCP库存和最终浓度
  3. 在MilliQ-H ₂ O中制备5M叠氮化钠。
    1. 在MilliQ-H ₂ O中制备500μl叠氮化钠稀释液至500 mM。＆nbsp;
    2. 关于叠氮化钠原料浓度和稀释度，请参阅表2。
      
      表2.叠氮化钠原料和最终浓度
  4. 45分钟后，使用A / D和B / C化合物装载导板将化合物装入进样口，将化合物分配到水合滤芯的进样口，以防止化合物交叉污染。＆nbsp;
  5. 要将25μl的90μMPFC加载到进样口A，将A / D化合物加载导板放在水合物传感器盒的顶部。确保复合装载导板上的字母A位于左上角。使用拇指和食指握住装载导板，以便在装载过程中将其固定，以使移液器吸头不会从装载导板上脱落。有关复合装载导板和药物注射口的布局，请分别参见图1B和图2。
  6. 类似地，使用B / C化合物装载导板将25μl500mM叠氮化钠装入注射口B.分别参见图1B和2，了解化合物装载导板和药物注射口的布局。
  7. 将含有25μl90μMFCCP的水合滤芯装入A口，将25μl500mM叠氮化钠装入B口。不要将药物装入A1，A12，H1和H12井的A口或B口。有关复合装载导板和药物注射口的布局，请分别参见图1B和图2。
    
    图2. XF传感器盒中药物注射端口的布局
  注意：
  1. 端口A和B必须填充相同数量的药物或缓冲液。未使用的端口C和D可以保持为空。＆nbsp;
  2. 避免在进样口产生气泡。＆nbsp;
  3. 在将化合物装入进样口后不要轻敲药筒，因为这会导致化合物从进样口泄漏。
  1. 将25μlM9缓冲液加载到孔A1，A12，H1和H12的端口A和25μlMilliQH ₂ O中，进入孔A1，A12，H1和H12的端口B. A1，A12，H1和H12井是用于背景校正的空白孔。＆nbsp;
  2. 将含水墨盒放在装有XF校准液的实用板上。＆nbsp;
  3. 使用“Wave controller”软件设置协议。
  4. 小心地将装有化合物的水合墨盒装入XFe96海马分析仪。＆nbsp;
  5. 启动协议以校准水合传感器盒（校准时间约为40-50分钟）。
3. 转移 C.线虫＆NBSP;
  1. 在校准期间，将200μlM9缓冲液吸移到新鲜实用板的每个孔中。＆nbsp;
  2. 使用蠕虫镐将10只蠕虫转移到每个孔中。对于每种情况，必须至少进行6次重复实验。＆nbsp;
  3. 对于每个平板，包括6个具有相同量的OP50（蠕虫食物）的孔。这用作测量来自蠕虫肠内细菌的基线OCR的对照。
  4. 关于使用用10mM百草枯处理的N2和N2进行实验设计，请参考图3中的板布局。
    
    图3.使用10 mM百草枯处理N2和N2进行实验设计的平板布局
4. 运行海马XF测定
  1. 完成传感器盒校准后，取下校准板并更换含有200μlM9缓冲液中的蠕虫的实用板。＆nbsp;
  2. 取下实用板的盖子，将平板放入XFe96分析仪中。＆nbsp;
  3. 开始平衡。＆nbsp;
  4. 完成平衡后，测定将根据之前设定的方案自动开始获得基线测量。＆nbsp;
  5. 使用以下方案测量 C中的线粒体呼吸。线虫。
    基础呼吸测量
    1. 循环6次
    2. 混合3分钟＆nbsp;
    3. 延时2分钟＆nbsp;
    4. 测量3分钟
    5. 循环结束
    注入端口A：
    1. 循环6次
    2. 混合3分钟
    3. 延时2分钟
    4. 测量3分钟
    5. 循环结束
    注入端口B：
    1. 循环6次
    2. 混合3分钟＆nbsp;
    3. 延时2分钟＆nbsp;
    4. 测量3分钟
    5. 循环结束
  6. 在运行结束时，将数据保存在默认的XF细胞能量表型分析结果文件（* .asyr）中，该文件只能使用XF波形软件查看。将数据导出到excel文件（* .xlsx）和GraphPad（.pzfx）文件以进行进一步分析。

数据分析

结果最初是从XFe分析仪的动力学图表类型中查看的，图4.

图4.动力学OCR图。该实验研究了用10mM百草枯处理的野生型N2，N2处理的线粒体代谢和用于培养线虫的细菌耗氧量。
在加入化合物（FCCP后加叠氮化钠）之前和之后，使用氧消耗率曲线下面积（OCR），以确定基础呼吸，最大呼吸和备用呼吸能力。＆nbsp;
通过从测量值13到18（钠后）减去非线粒体呼吸，曲线下面积（总OCR），确定测量1到6（FCCP注射前）的曲线下面积（总OCR）来确定基础呼吸叠氮化物注射）。参见图5.

图5.使用 C执行的Seahorse实验的OCR配置文件的典型示例。线虫，从图3中N2的OCR重新绘制。最初测量基础呼吸率，然后进行FCCP注射，这样可以确定最大和备用呼吸率。
通过从测量7至12（叠氮化钠注射之前）确定曲线下面积（总OCR）并减去非线粒体呼吸13至18（叠氮化钠注射后）来确定最大呼吸。参见图5。
通过测量从测量值6到18（叠氮化钠注射之前）的曲线下面积（总OCR）确定备用呼吸，并在测量1到6处减去基础呼吸。参见图5.＆nbsp;
将基础呼吸，最大呼吸和备用呼吸能力标准化为每口井中的蠕虫数量（每孔10个蠕虫）。＆nbsp;
将实际基础呼吸，最大呼吸和备用呼吸能力标准化为细菌呼吸率。＆nbsp;
将条形图中获得的数据用于比较治疗线虫和未治疗线虫之间的呼吸率（图6A-6C）。＆nbsp;

图6.比较我们的标准化工作流程和实验后分析后用10 mM百草枯处理的野生型N2和N2的基础（A），最大（B）和备用呼吸（C）的条形图。数据将其绘制为平均值±SEM，使用Student's t -test进行分析。在图中， P 值≤0.01总结为两个星号， P 值≤0.0001总结为四个星号。

笔记

由于不同的实验条件，不同运行的OCR值可能不同：缓冲液中的蠕虫时间，海马分析仪的温度变化，不同的传感器盒，因此，实验必须在同一板上进行。＆nbsp;
Seahorse XF分析仪没有温度控制，必须关闭加热器，并且必须将分析仪放在温度较低的房间内。该实验现在取决于环境温度，并且通常在运行期间温度将增加2至4℃。我们测试了温度的升高，发现它不会对线虫的OCR产生显着影响。

食谱

线虫生长培养基（NGM）琼脂
对于1升介质：
3.0克NaCl
17.0克Bacto琼脂
2.5克细菌蛋白胨
高压灭菌器对琼脂进行灭菌，冷却至55°C，然后加入：
1毫升1M MgSO 4 （过滤灭菌）
1毫升1M CaCl ₂（过滤灭菌）
1毫升5毫克/毫升胆固醇在无水乙醇（过滤消毒）
1毫升200毫克/毫升链霉素（过滤灭菌）
25毫升1M KPO ₄（配方4）
M9缓冲液（1升）
3克KH ₂ PO ₄
6g Na ₂ HPO ₄
5克NaCl
高压灭菌器，然后添加：
1毫升1M MgSO 4 （过滤灭菌）
用于蠕虫同步的次氯酸盐溶液
准备家用漂白剂（5％次氯酸钠溶液）和5 N NaOH，比例为2：1
1 M KPO ₄（1 L）
108.3g KH ₂ PO ₄
35.6g K ₂ HPO ₄
H ₂ O至1 L
过滤消毒

致谢

我们感谢Caenorhabditis遗传中心提供蠕虫菌株。 Grant IG17-LR005和IG17-BS101的财政援助也得到了承认。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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