材料和试剂

Drosophila 饲养
1. 6盎司 Drosophila 原料瓶（Genesee Scientific，目录号：32-130）
2. 储存瓶用棉球（Genesee Scientific，目录号：51-102B）
3. CantonS苍蝇（Bloomington Drosophila Stock Center，目录编号：64349）（flystocks.bio.indiana.edu）
4. 琼脂（VWR，BDH ®，目录号：20768-361）
5. 糖（家乐福或任何其他超市）
6. 玉米粉（AB，Celnat-NaturDis）
7. 酵母（Biospringer，目录号：BA10 / 0-PW）
8. Tegosept（Apex，Fly Food防腐剂，Genesee Scientific，目录号：20-258）
9. 果蝇的标准营养培养基（见食谱）
细菌培养
1. 培养皿（Thermo Scientific-Nunc TM ，目录号：263991）
2. 无菌技巧（Sigma Aldrich，目录号：CLS4138）
3. 15毫升管（Corning，Falcon ®，目录号：352096）
4. 量筒（Azlon，目录号：11940985）
5. 根据代码4D22在芽孢杆菌遗传库中心鉴定的苏云金芽孢杆菌 var。 kurstaki （ Btk ）菌株（< a href =“http://www.bgsc.org/”target =“_ blank”> http://www.bgsc.org/ ）并由Gonzalez 等人描述，1982
6. Luria肉汤粉（Conda，目录号：1551）
7. 琼脂细菌学（Euromedex，目录号：1330）
8. LB培养基（见食谱）
9. LB-琼脂培养基（见食谱）
接种
1. 用于25 mm窄瓶的棉球（Genesee Scientific，目录号：51-101）
2. 分光光度法比色皿（Ratiolab，目录号：2712120）
3. 2毫升微管（Paul Boettger，目录号：02-043）
4. 20 mm过滤盘（3 MM Chr色谱纸; GE Healthcare，目录号：3030-917）
5. 50毫升管（Fisher Scientific，目录号：10788561
6. 25 mm窄果蝇小瓶（Genesee Scientific，目录号：32-109RL）
7. 蔗糖（Euromedex，目录号：200-301-B）
8. 5％蔗糖（见食谱）
9. 1 mM R19-S（Futurechem，FC-8001，首尔，韩国）（见食谱）
解剖
1. 10x PBS（Euromedex，目录号：ET330）
2. 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
化验
1. 1.5 ml microtubes（Paul Bottger，目录号：02-063）
2. 12孔黑色微孔板（VWR国际，目录号：734-2324）
3. 铝箔（可在任何超市购买）
4. 甲醛16％（Thermo Scientific，目录号：28908）
5. Vectashield / DAPI（Sigma，目录号：F6057）
6. 4％甲醛（见食谱）

设备

Drosophila 饲养
冷藏炉在25℃的恒定温度和12小时/ 12小时光/暗循环（Fisher Scientific，目录号：11857552）。湿度必须保持在40％至70％之间。
细菌培养
1. 500毫升无菌烧瓶
2. 30°C振荡培养箱（Infors，型号：AK 82）
接种
1. 分光光度计（Aqualabo，Secomam，型号：Prim Light＆amp; Advanced）
2. CO ₂ - 麻醉系统（INJECT + MATIC睡眠者）
解剖
1. Dumont镊子＃5（精细科学工具，目录号：11251-20和11252-20）
2. 手表玻璃（Steriplan培养皿，DWK Life Sciences，目录号：237554008）
3. 立体显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica M60）
分析
荧光显微镜（Zeiss Axio Imager Z1 Apotome）配有相机（AxioCam MRm）和罗丹明43荧光滤光片

软件

ZEN 2012（蔡司）
ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）
Kyplot（ http://kyenslab.com/en/index.html ）
Excel（微软）

程序

Drosophila 饲养
1. 广东S苍蝇（布卢明顿）在25°C下用标准培养基饲养 Drosophila melanogaster （见食谱）。
2. 为了获得同步交配的雌性，从饲养瓶中取出成年果蝇并等待新蝇的出现一天。然后，在接种前，将新出现的果蝇（雄性和雌性）在25°C下再转移到新瓶中5天。在我们的实验中，使用了五到六天大的交配雌性。
  注意：如果你想只对原始雌性开展工作，一旦新的苍蝇孵化出来，立即将雄性幼虫移走并将处女雌性放入分开的小瓶中，直到它们达到正确的年龄。
细菌培养
在下面给出的实验中，用 Btk 细菌菌株接种果蝇（参见材料和试剂）。 5％蔗糖溶液用作阴性对照（Ctrl）。
1. 将来自原种的细菌传播到LB琼脂培养皿上并在30℃下生长过夜。
2. 使用无菌尖端挑选单个菌落，并在500ml无菌烧瓶中接种250ml LB，并在30℃下以180rpm振荡孵育过夜。
  注意： Btk 的增长非常有效。没有必要的初学者文化。
接种
1. 在感染当天，将5至6日龄雌性与雄性分开并放入不含培养基的小瓶中，在25℃下饥饿2小时。这确保了当它们被引入具有细菌的培养基时食物摄入的同步。
2. 在此期间，测量过夜细菌培养物的光密度（OD）。如有必要，稀释过夜培养物，使OD值在0.2和0.8之间。
3. 细菌溶液的制备：用 Btk 果蝇的10 8 菌落形成单位（CFU）接种果蝇所需的OD列于表中1.
  
  表1.细菌溶液
  
  注意：
  1. 过夜培养物的OD明显过低，你必须集中精力。通过在室温下以2,500xg旋转15分钟来沉淀细菌培养物。根据公式fOD x fV = iOD x iV（fOD =最终OD; iOD =初始OD，fV =最终体积; iV =初始体积），用所需体积的5％蔗糖重悬沉淀以得到正确的CFU。例如，为了从OD 2（iOD）的过夜培养物中获得 Btk 细菌的OD 400（fOD），旋转25ml细菌培养物（iV）和将沉淀重悬于5％蔗糖中，比初始体积LB小200倍，因此fV =125μl。＆nbsp;
  2. 可以用任何其他细菌接种苍蝇。但是，根据细菌的类型，产生所需CFU所需的OD可能会有所不同。
4. 将1mM R19-S储备溶液（参见配方）稀释至100μM蔗糖5％。将稀释液保持在黑暗中。
5. 用100μMR19-S探针溶液以1：1的比例稀释细菌溶液（表1）。该混合物将构成接种溶液。
  1. 通过组合25μl的100μMR19-S溶液和25μl的5％蔗糖来制备阴性对照批次。
  2. Btk 批次是通过组合25μl100μMR19-S和25μl Btk 溶液制备的（OD <子> 400 ）。使用的细菌浓度为1×10 8 sup CFU / 5cm 2 / fly。
  注意：R19-S混合物的制备必须在黑暗条件下进行。
6. 在 Drosophila 窄小瓶内的培养基顶部放置一个20毫米的滤盘（图1A和1B）。
7. 将接种溶液存放在过滤盘上（图1C）。
8. 将10只饥饿的果蝇转移到一个 Drosophila 窄瓶中，让 Drosophila 在接种溶液中喂食30分钟（图1D）。
  注意：对于30分钟的时间点，请跳过下面的步骤C9并按照以下程序D中的描述剖析苍蝇。
9. 从小瓶中取出苍蝇，将其放入新鲜的小瓶中，过滤盘仅浸泡25μl的100μMR19-S溶液+25μl的5％蔗糖。让苍蝇喂食直到解剖时间（1小时和1.5小时）。
  
  图1.接种程序。 A.切割直径为20 mm的过滤盘。 B.放在小瓶内的培养基顶部。 C.将接种溶液存放在过滤盘上。 D.介绍苍蝇。
解剖（视频1）
在所需的时间点：0.5小时，1小时和1.5小时开始解剖。
1. 在开始之前，必须用70％乙醇溶液冲洗钳子和解剖表眼镜。
2. 使用 Drosophila -Sleeper，用CO ₂麻醉每种条件下10只雌性。
3. 将一只苍蝇放入预先装有1 ml 1x PBS的表玻璃中（参见食谱）。
4. 使用镊子，将头部拉开。轻轻握住苍蝇，在胸部/腹部边界处切开腹部。轻轻地将腹部与胸腔分开。您应该看到肠道仍然附着在胸部和腹部。
5. 然后，小心地拉伸肠。
6. 在前肠和后肠之间的边界切开肠道。如果仍然连接到中肠/后肠边界的中肠，则去除Malpighian小管和/或卵巢。
  注意：如果可能，必须在小于30 s /肠道内进行解剖，以避免R19-S荧光褪色。
视频1.解剖程序
样品制备和图像捕获
1. 在室温下在12孔板中将500μl含4％甲醛的PBS（参见食谱）中的 Drosophila 肠道固定，在黑暗中不搅拌50分钟。
  注意：用铝箔覆盖板，使肠道样本保持在黑暗中。
2. 用PBS冲洗两次（2 x 5分钟）。
3. 对于每个实验，在Vectashield / DAPI中安装内脏并立即使用荧光显微镜（具有Apotome 2显微镜的Zeiss Axioplan Z1）观察样品。在“罗丹明”发射范围内（在515nm激发）可见R19-S荧光。还采用差分干涉对比度（DIC）图像与荧光图像合并。
4. 拍摄中肠前部的照片，因为那里会产生HOCl。下面，在图2中，我们给出了两个条件（H ₂ O和 Btk ）的结果。对于每种情况，我们进行了3次（30分钟和1小时）或4次（1.5小时）的独立实验。
  
  图2.图像捕获。 A.使用罗丹明过滤器（橙色）捕获Apotome图像以显示R19-S荧光，并使用差分干涉对比（DIC）通道来勾画肠道轮廓。图像被捕获在中肠的前部。 Ctrl：5％蔗糖阴性对照批次。 Btk ： Btk 批次。 B-B”。在管腔水平的前中肠的横截面。 R19-S荧光（橙色）定位于面向腔的上皮的顶面。蓝色（DAPI）标记上皮细胞核。 B包含用于定向的DIC图像，而B'不包含。

数据分析

对于每种情况，分析至少3次在不同日期进行的独立实验。＆nbsp;
当您组合三个独立实验时，每个条件至少需要分析20个肠道。如果不是这种情况，您必须进行补充实验，以达到20个肠道的阈值。
每个实验独立计算R19-S阳性肠的百分比。当至少10％的前中肠显示荧光标记概述肠细胞膜时，肠被认为是R19-S标记阳性。不考虑分散的细胞。
注意：对于每个实验，在对照条件下（用5％蔗糖喂养）的R19-S阳性肠的数量不得超过肠的25％。这表明苍蝇在实验之前或期间经历了意外的压力。因此，如果在对照实验中超过25％的肠道是R19-S阳性，则丢弃所有实验（对照和细菌感染的批次）。＆nbsp;
汇总每个条件的3个（或更多）独立实验，并进行比较，如下图Excel图所示（图3）。
统计分析
如果n < 30个肠道，使用Kplot软件执行非参数Kruskal和Wallis测试。
如果n≥30个肠，使用Excel或Kplot软件执行参数 t - 测试。

图3. R19-S阳性中肠的百分比。 R19-S阳性中肠以橙色和R19-S阴性中肠以灰色表示。在接种后30,60和90分钟获得数据。 Ctrl：阴性对照批次。 Btk ： Btk 批次。从27＆lt; n＆lt; 31，我们使用非参数Kruskal和Wallis测试。

食谱

标准营养培养基果蝇 melanogaster
注意：所有试剂均用蒸馏水制备。
8克/升琼脂
25克/升糖
80克/升玉米粉
20克/升酵母
6 g / L tegosept（在95％乙醇中100 g / L的储备溶液。在4°C下储存）
LB介质
1. 称出25克Luria肉汤培养基粉末
2. 在量筒中用蒸馏水调节至1L
3. 如有必要，将pH调节至7.2
4. 高压灭菌＆NBSP;
LB-琼脂培养基
1. 称出25克Luria肉汤培养基粉末＆nbsp;
2. 在量筒中用蒸馏水调节至1升＆nbsp;
3. 如有必要，将pH调节至7.2＆nbsp;
4. 加入15克琼脂粉＆nbsp;
5. 高压釜＆NBSP;＆NBSP;
5％蔗糖
1. 在50毫升管中称出2.5克蔗糖＆nbsp;
2. 加入50毫升无菌蒸馏水并涡旋＆nbsp;
注意：在使用前制作解决方案。
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
1. 在量筒中将100ml 10x PBS溶液加入900ml蒸馏水中
2. 高压灭菌＆NBSP;
4％甲醛
将750μl1xPBS溶液加入250μl16％甲醛中
1mM R19-S
1. 从市售粉末中在100％乙腈中制备1mM的储备溶液＆nbsp;
2. 在黑暗中于4°C储存。必要时制作等分试样

致谢

SH得到了法国政府的支持，通过国家研究机构管理的UCA JEDI 投资未来项目（ANR;参考编号ANR-15-IDEX-01）。 CN由INRA和AG支持OB。这里介绍的程序改编自Lee和来自Won-Jae Lee实验室的同事。

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益。

参考

Benguettat，O.，Jneid，R.，Soltys，J.，Loudhaief，R.，Brun-Barale，A.，Osman，D。和Gallet，A。（2018）。 DH31 / CGRP肠内分泌肽引发肠道收缩，有利于消除机会性细菌。 PLoS Pathog 14（9）：e1007279。
Bonfini，A.，Liu，X。和Buchon，N。（2016）。从病原体到微生物群： Drosophila 肠道干细胞对肠道微生物的反应。 S0145-0305X（0116）30032-30035。
Gonzalez，J.M.，Jr.，Brown，B.J。和Carlton，B.C。（1982）。转移苏云金芽孢杆菌质粒编码菌株中的δ-内毒素of B.苏云金芽孢杆菌和 B。 cereus 。 Proc Natl Acad Sci U S A 79（22）：6951-6955。＆nbsp;
Kim，S。H.和Lee，W。J.（2014）。 DUOX在肠道炎症中的作用：来自 Drosophila 模型的经验教训肠道 - 微生物群的相互作用。 Front Infect Microbiol 3：116。
Lee，K.A.，Kim，S.H.，Kim，E.K.，Ha，E.M.，You，H.，Kim，B.，Kim，M.J。，Kwon，Y.，Ryu，J.H。和Lee，W.J。（2013）。细菌来源的尿嘧啶作为果蝇中粘膜免疫和肠道微生物体内平衡的调节剂。 Cell 153（4）：797-811。
Xia，X.，Cheng，L.，Zhang，S.，Wang，L。和Hu，J。（2017）。天然抗菌肽在感染和慢性炎症中的作用。 Antonie Van Leeuwenhoek 30（10）：017-0929。