材料和反应

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1毫升带针的syringe (GEMTIER，目录编号:0.45x16 RW LB)
白色水果F。草莓品种“甜美的查理”
二进制向量:外泄用pK7WG2D, RNAi用pK7WIWG2D。两个向量contain a 35S: GFP视频记者
目标基因:FveMYB10， FvH4_1g22020/gene31413;说唱, FvH4_1g27460 / gene31672
最近的提取(OXOID，目录编号:LP0021)
Tryptone (OXOID，目录编号:LP0042)
Agar (TSINGKE，目录编号:1182GR500)
MS(物理技术实验室，目录编号:M404-50L)
GV3101化学能力细胞(上海生物技术，目录编号:AC1001)
NaCl (HUSHI，目录编号:10019318,CAS: 7647-14-5)
Sucrose (HUSHI，目录编号:10021418,CAS: 57-50-1)
抗生素，包括Kanamycin (Kan)， Gentamicin (Gent)， Rifampicin (Rif)，和Spectinomycin (Spe) (Biofroxx，目录编号:1162GR005, 1463GR001, R3501，和S8040，尊重)
罗利亚肉质(LB)中
注入缓冲区(见模式)
抗生素(见处方)

设备

孵化器用于生长 28度C (JINGHONG，目录编号:DNP-9022)
双温控恒温器(MIULAB，目录号:BTH-100)
离心机(埃普多夫,5424)
Clean workbench (AIRTECH, SW-CJ-1FD)
全温振动筛(培英，目录号:THZ-C-1)
超低温冰箱(ThermoFisher SCIENTIFIC, Thermo SCIENTIFIC TM Forma< /sup> TM 88000)
荧光解剖立体显微镜(徕卡，目录号:M205FA)
植物生长室:25±3°C, 16 h光/ 8 h黑暗,光强度在100μmol m <一口> 2 < /一口>秒1 <一口> < /一口> < br / >

过程

在生长室内种植草莓植物3到4个月，直到花朵开放。
人工授粉;等到果实发育到大的绿色阶段，授粉后约15-20天，花托开始变软。
将35S::FveMYB10 construct (binary vector pK7WG2D)转化为Agrobacterium tumefaciens strain GV3101，或者使用储存在超低温冰箱中的Agrobacterium stock。选择一个阳性菌落，放入2毫升液体LB培养基中，使用适当的选择性抗生素，本例中为Gent + Rif + Spec。
以220转/分的速度，在28°C下摇匀培养过夜(~12-16 h)。
(可选)用常规PCR扩增载体片段，确保培养正确。
将培养物在2500 x g处旋转5分钟，弃上清。用注射缓冲液(MS盐+ 2%蔗糖)暂停培养，最终OD600，为0.8。< br / > 注:1毫升细胞悬液足以注射5-8个果实。两毫升的培养液通常可制成4毫升的细胞悬浮液。如果需要更多的注射，农杆菌培养物的体积可以增加。
立即使用1毫升皮下注射器进行注射。将溶液吸进注射器，将针尖从顶端插入果实中心，轻轻按压注射器释放溶液。对于一个大的水果，例如栽培的草莓，有时需要在水果的其他部分注射更多的针剂，使整个水果浸泡在溶液中(视频1)。< br / > 注:每个构形至少注入10个果实。使用仅用注射缓冲液浸润的水果作为阴性对照。 < br / > < br / > < br / > 视频1。步骤7 所述的水果注射程序 < br / >
在标签上写下结构名和日期，并将标签绑在水果茎上。把植物放回生长室，让水果生长一周左右。< br / > 注:注射后约3天，果实可能开始着色。
用荧光解剖立体显微镜检查果实颜色和GFP信号(如有必要)。拍照或收集组织进行下游分析。< br / > 注:切开果实观察内部表型。如有必要，GFP荧光可作为收集组织进行下游分析的指南。 < br / >

数据分析

果实F。采用大绿期(授粉后15-20天)vesca加入YW瞬时过表达FveMYB10(图1A)。我们可以看到注入的水果在容器表皮下充满了水(图1B)。一周后，果实着色完全完成(图1C)。通常情况下，花托的某些部分会变成红色，而其他部分则保持白色。当果实被切成两半时，靠近果皮的组织会变红，而内部仍然是白色的。GFP荧光强度与果实着色有很好的相关性(数据未显示)。相反，只注射缓冲液(阴性对照)的水果保持白色(图1D)。在栽培草莓中，花青素的合成或成熟基因常发生短暂的修饰。为了说明该方法也适用于基因敲除，我们展示了用RAP-RNAi构建物(二元载体pK7WIWG2D)对栽培草莓果实进行瞬时转化(图1E) (Luo et al.， 2018)。值得注意的是，虽然GFP和RAP在一个结构中分别由35S本构子启动子驱动，但具有GFP荧光的部分与具有颜色变化的部分重叠。< br / > < br / > 图1 。短暂转化草莓果实的表型。 A.一个水果的F。在大的绿色阶段，vesca加入YW。B.和刚才注射的A的水果是一样的。C.注射FveMYB10< /em> -ox construct一周后，YW果实呈现红色。D.对照YW果实只注射了注射缓冲液。E.草莓品种‘Sweet Charlie’的一个果实在注射RAP-RNAi构形一周后，花青素积累减少。右图为荧光显微镜拍摄的GFP信号。标尺= 1厘米。

笔记

由于注射用的果实发育阶段的限制，农杆菌介导的转化更适合研究调控后期发育过程的基因，如果实成熟和果实品质的形成(着色、香气和味道的形成、等)。
在不同的水果之间，即使在一个水果内，转化效率也有很大的差异。我们建议使用携带可见报告基因的载体来促进表型观察和组织收集。GFP荧光蛋白质或其他更好的选择比β-glucuronidase(格斯)。
在25℃左右种植。较低或较高的温度(30℃)会大大降低效率，甚至导致完全失效。
我们成功地将含有两种结构的农杆菌混合物按1:1的比例进行转化。这为检验两个或多个基因之间的相互作用提供了更多的可能性。
除了 F。vesca 和 F。×ananassa，该方法同样适用于其他Fragaria种。
在这个短暂的草莓转化过程中，没有使用丙酮环酮。在草莓稳定转化过程中，将丙酮环酮加入孵育缓冲液中，需要孵育数小时的细胞悬液。这种优化可能在将来进行测试。< br / >

食谱

罗瑞亚肉汤(LB)培养基 10 g L-1 Tryptone 5 g L-1酵母提取物 10 g L-1 NaCl pH值7.0 < br / > 15 g L-1琼脂(固体LB培养基)
注入缓冲< br / > 0.44 g MS粉末 2克蔗糖 100ml ddH2O pH值5.8
抗生素< br / > 50 mg L-1 Gent 50 mg L-1 Rif 50 mg L-1 Spe

致谢

康的实验室工作得到了国家自然科学基金(31572098、31772274、31822044)的支持。本协议是从我们之前发表的工作中修改而来的(Luo et al.， 2018)。

相互竞争的利益

所有的作者都说他们没有竞争优势。

参考

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霍夫曼,T。， Kalinowski, G.和Schwab, W.(2006)。 rnair -基因表达在草莓水果中的迷迷性沉淀(Fragaria a href= https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30729008”“>×< / > ananassa )由agroinfiltration: a快速吸附法for吉恩function分析。植物 48(5): 818-826
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