材料和试剂

牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A9576）
无菌Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
NH 4 Cl溶液（StemCell Technologies，目录号：07850）
手术刀或剃刀刀片
EasySep Negative Selection Kit（StemCell Technologies，目录号：19757）
Accutase（ITC，目录号：AT104）
胶原酶（StemCell Technologies，目录号：07912）
青霉素/链霉素（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10378-016）
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12（Sigma-Aldrich，目录号：D8437）

设备

回转桶离心机
孵育摇床
EasySep磁体（StemCell Technologies，目录号：18000）
无菌尼龙网40微米细胞滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352340）
50ml锥形管

程序

牺牲或麻醉动物，并通过使用图钉将其脚钉入泡沫表面来约束动物。沿着小鼠的腹部从尾根部到颈部做一个平行的切口，小心不要刺破腹膜。轻轻拉回皮肤，并将其固定到泡沫表面以显露肿瘤。切除肿瘤免于皮肤和身体，仔细除去尽可能多的肿瘤周围的多余组织
将收获的肿瘤存储在无血清DMEM/F12培养基中的冰上，直到消化程序。
注意：移除肿瘤后应尽快消化。我们不会在冰上推荐超过1小时。
在10cm培养皿中，使用剃刀或解剖刀将肿瘤（0.5-1.0mg或更多取决于实验需要）切成1-2mm片，并放入50ml锥形管中。这应在室温下在生物柜中进行。可以向肿瘤中加入少量消化介质以使切碎更容易。在冰上剁碎细胞不是必要的。肿瘤应该有效地切碎，但不要急于取出，以留下太大的碎片
将消化介质以50：1的比例与肿瘤体积比例加入到50 ml锥形管中，使得管中的消化介质比肿瘤大约多十倍。
将管牢固地放置在倾斜位置的培养摇床上，使培养基和肿瘤不断混合。在37℃下消化切碎的肿瘤3-5小时。虽然一些肿瘤可能残留，但检查大多数肿瘤已经溶解完全消化
用消化的肿瘤以1:1的比例用含有0.2％BSA的DMEM/F12稀释消化的混合物。这将导致音量翻倍。
通过40微米无菌尼龙网格细胞过滤器将混合物过滤到另一个无菌的50ml锥形管中。从这一点开始，除了在离心和用Accutase消化之前，始终将细胞保持在冰上
在200 x 下旋转过滤的细胞5分钟，除去上清液。
将细胞重悬在适当体积的DMEM/F12-0.2％BSA中以洗涤（〜1ml/ml细胞沉淀）。
再次以200 x em/g 再次旋转细胞5分钟，除去上清液。
为了裂解污染沉淀的细胞的红细胞，首先混合4ml NH 4 Cl和1ml PBS-1.0％BSA（4:1比率），并使用该混合物重悬沉淀物（这些计算对于占据大约5ml体积的沉淀是合适的。应当针对颗粒的尺寸调整NH 4 Cl和PBS-1.0％BSA的量，其中比例保持4：1 ）。离开细胞在溶液中2-3分钟在室内温度取决于RBC污染的量，其可以通过存在红色来确定。如果肿瘤血管充分，血小板颜色非常红，则重复该步骤，直到红色消失。
将细胞以200×em/g 离心5分钟，除去上清液。
在DMEM/F12-0.2％BSA中洗涤细胞沉淀并离心细胞。重复该步骤几次，直到上清液变得澄清。
如果在培养基洗涤期间细胞团聚在一起，在37℃下用1ml Accutase消化1-2×10 6个细胞10分钟以解离聚集的细胞。
每1ml Accutase加入2ml DMEM/F12-0.2％BSA，并通过吸移混合以中和酶的反应。
将细胞以200 x em/g 离心5分钟，然后用PBS洗涤细胞。
除去上清液并悬浮在适当体积的PBS中用于颗粒大小（每ml存在的沉淀约1ml）。将细胞储存在冰上直到隔离。
然后可以使用EasySep阴性选择试剂盒根据制造商的说明书分离来自乳腺的谱系标记物阴性（Lin ^-）上皮细胞。这将通过用针对非上皮细胞的抗体靶向这些细胞来去除不想要的细胞。谱系标记物阳性（Lin +），非上皮细胞被吸引到与EasySep阴性选择试剂盒一起使用所需的磁体，并且期望的细胞保持游离以被收集。这产生用于其他实验的纯化上皮样品
分离的细胞可以在冰上保持至少1小时，直到它们用于实验分析。分离细胞也可以保存在适当的细胞冷冻培养基中，然后储存在-80℃或液氮中长期储存。

食谱

肿瘤消化培养基（50ml）
25 ml Accutase
50 mg胶原酶
0.5ml 100x青霉素/链霉素 24.5ml Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12

致谢

该方案首先在我们的手稿Lo 等人（2012）中描述。这项工作得到了Elsa U. Pardee癌症基金会资助（B94AFFAA），美国癌症协会研究奖（RSG-10-067-01-TBE）到HC和NIH资助（3P20RR017698-08）到HC和QW的支持。

参考文献

Lo，P.K.，D.Kanojia，X.Liu，U.P.Singh，F.G.Berger，Q.Wang和H.Chen（2012）。 CD49f和CD61可识别Her2/neu诱导的乳腺肿瘤发生细胞，其潜在地来源于内腔祖细胞并通过整联蛋白-TGFβ信号传导维持。 Oncogene 31（21）：2614-2626