材料和试剂

吸管头(VWR，下一代低装订，目录号:89076-476,89076-486)
蛇皮TM膜(Thermo Fisher Scientific，目录号:68035,88244)
Superdex S200 10/300 GL尺寸排除色谱柱(GE Healthcare)
HiTrap肝素亲和色谱柱(GE Healthcare，目录号:17040601)
蛇皮TM透析夹(Thermo Fisher Scientific，目录号:68011)
PVDF薄膜(Thermo Fisher Scientific，目录号:88518)
1.5 ml离心管(Fisher Scientific，目录号:05-408-129)
3毫升注射器，Luer锁(Becton Dickinson，商品编号:BD309657)
100x10mm LB板培养皿(VWR，目录号:25384-324)
pSpeedET载体，DNASU质粒库(EvNO00285791) 注:pSpeedET必须有n端E。大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)融合标记
Lemo21 (DE3) E。大肠杆菌(新英格兰Biolabs® Inc.，目录号:2528J)
引物< br / > 31F: 5 ' ctgtacttccagggcaccacattagagagaaggagcac 3 ' 406R_noGFP: 5 ' gtttaattaagtcgcgtta cttcttgtgttcttcattcggc 3 '
Phusion®高保真PCR试剂盒(新英格兰Biolabs® Inc.，目录号:C2528J)
(Thermo Fisher ScientificTM，目录号:K0691)
通用电气医疗保健插图TM质粒制备微型自旋试剂盒(GE医疗，目录号:GE28-9042-69)
二甲基亚砜(DMSO) (Sigma-Aldrich，目录号:D650-5X5 ML)
琼脂糖(龙沙SeaKem LE，目录号:50004)
SOC恢复介质(Thermo Fisher Scientific，目录号:15544034)
卡那霉素(国际研究产品，目录号:K22000)
氯霉素(国际研究产品，目录号:C61000)
卡宾西林(国际研究产品，目录号:C46000)
极好的肉汤(TB) (Sigma Aldrich，目录号:T0918)
- d -1-硫代半乳糖苷(IPTG) (Sigma-Aldrich，目录号:l6758-1G)
DNase I(新英格兰生物抗体，目录号:m0303)
CaCl2 (Fisher Scientific，目录号:AC349610250)
苯扎脒(Sigma-Aldrich，目录号:449709)
无国界医生组织(Sigma-Aldrich，目录号:10837091001)
蛋白酶抑制剂E-64 (Sigma-Aldrich，目录号:E3132)
胃蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich，目录号:P5318-5MG)
百思他汀(Sigma-Aldrich，目录号:B8385-1MG)
β-mercaptoethanol (BME) (Sigma-Aldrich、目录号:M6250)
e2TAK聚合酶(Takara Bio，目录号:RF001A)
(VWR® Amresco< /sup>®生命科学，目录号:N789-1L)
抗mbp抗体(新英格兰生物抗体，目录号:E-8038)
tris -甘氨酸凝胶8-16% (NuSep，目录号:NG15-816)
n-dodecyl-β-D-maltoside DDM (Anatrace目录号:D310)
KPL TMB膜过氧化物酶底物系统试剂盒(血清护理，目录号:5420-0025)
Amresco RapidBlockTM solution (VWR，目录号:97064-124)
NaCl (Sigma-Aldrich，目录号:S9888)
pH 7.5 HEPES (VWR，目录号:97061-822)
MgSO4 (Sigma-Aldrich，目录号:M7506)
甘油(Sigma-Aldrich，目录号:G9012)
Tris-HCl pH 7.5 (Sigma-Aldrich，目录号:10812846001)
吐温20 (Sigma-Aldrich，目录号:P9416)
盐酸胍(Sigma-Aldrich，目录号:G3272)
二硫苏糖醇(DTT) (Sigma Aldrich，目录号:DTT- ro)
l -半胱氨酸(Sigma-Aldrich，目录号:168149)
咪唑(Alfa Aesar，目录号:AA47274)
凝胶绿® (Biotium, catalog number: 41005)
LB琼脂(VWR，目录号:97064-106)
NEB® 5-alpha Competent E。杆菌(高效率)DH5α细胞(新英格兰生物学实验室,产品目录号:C2987l)
库马斯亮蓝(Thermo Fisher Scientific，目录号:20279)
FGF1 pMCSG7质粒(DNASU质粒库，目录号:HsCD00343156)
hrp标记的抗mbp抗体(新英格兰生物抗体，目录号:E8038)
牛奶Powder
裂解缓冲液(见配方)
TBST(参见食谱)
变性缓冲透析溶液#1(见配方)
透析溶液#2(见配方)
肝素亲和层析结合缓冲液(见配方)
肝素亲和层析洗脱缓冲液(见配方)
FGF1洗脱缓冲液(见配方)
SEC运行缓冲区(参见菜谱)
阻塞缓冲区(参见菜谱)

设备

困惑，125毫升的Erlenmeyer烧瓶(Sigma-Aldrich，目录号:CLS4444125)
Pipettes(吉尔森，Pipetman Classic)
收集升细胞培养用离心机(Thermo Fisher, Sorvall，产品编号:ST16)
台式微型离心机(Eppendorf，型号:5415)
PCR热循环仪(Thermo Scientific，型号:Hybaid PX2梯度热循环仪)
声波探伤仪(Thermo Fisher，型号:550声波探伤仪)
Akta净化器或FPLC (GE Healthcare, Akta净化器100 FPLC, Frac-950)
用于生长细胞的冷冻摇瓶/培养箱(New Brunswick, Innova 4230冷冻培养箱)
涡流器(Fisher Scientific，目录号:02215365)
JA20定角铝转子生物安全盖- 8 x 50 ml, 20,000 rpm, 48,400 x g (Beckman Coulter，目录号:334831)
磁性搅拌棒(Fisher Scientific，商品编号:14-513-83,14-513-93,14-513-95,14-513-94)
蠕动泵(Gilson, Rabbit Plus)
可见光/紫外分光光度计(Cary 50)
试管旋转器(科学仪器，型号:60448试管旋转器)
Western Blot仪(Bio-Rad)
Clare Dark Reader Transilluminator (Clare Chemicals, DR46)

软件

ApE(质粒编辑器)核苷酸分析程序(< A href="http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/" data-ke-src="http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/" target="_blank">http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/)
( https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq )

过程

第一部分:FGFR2细胞外和跨膜结构域的大规模表达和纯化 < br / >

通过聚合酶不完全引物延伸(PIPE)克隆合成FGFR2 ECD + TM结构聚合酶不完全引物延伸(管)克隆是一种较有效的选择克隆与限制和结扎酶。管道克隆不需要添加侧翼限制性位点，也不需要使用限制性酶对位点进行消化，然后进行磷酸化和结扎，而是从退火悬挑PCR末端进行独立于结扎的克隆，所需时间和成分更少。通过使用FGFR序列的一半引物和向量的另一半引物，向序列添加悬挑。现在位于FGFR序列两侧的单链悬垂物与向量序列互补。因此，将两者结合并进行后续转化，就形成了重组质粒(Klock and Lesley, 2009)。< br / > < br / >
1. 聚合酶链反应
  1. 根据Phusion®高保真PCR试剂盒说明书，使用引物制备FGFR2 ECD + TM(31-406)构建物，进行PCR反应。
  2. 添加6% DMSO溶液反应以及适当的PCR每个组件25μl FGFR2的反应和向量pSpeedET +麦芽糖结合蛋白(MBP)。
  3. PCR反应组件25μl反应是:< br / > FGFR/pSpeedET + MBP向量模板:20 ng /个 Phusion嗨富达缓冲:5μl < br / > Phusion嗨富达DNA聚合酶:0.25μl < br / > 0.2μM核苷酸(0.5μl 10毫米核苷酸)< br / > 0.5μM正向和反向引物(1.25μl 10μM股票)< br / > 6% DMSO: 1.5μl DMSO < br / > 1型nuclease-free水:增加25μl的总量
  4. 调整热循环的设置为: 98℃，6min; 循环35次，设置98℃，循环30秒;< br / > 50℃30秒 72℃2 min; 最后72°C保温10分钟，然后保温4°C。
  5. 在1%琼脂糖凝胶上运行PCR产物。
  6. 使用Thermo Scientific GeneJET®凝胶提取试剂盒提取预期长度的PCR产物。
  7. 期望长度为: tbody > < < td > 问题中的序列 < / td > < td > 期望尺寸(bp) < / td > < / tr > < td > FGFR2 31-406 (ECD + TM) < / td > < td > 783年< br / > < / td > < / tr > < td > pSpeedET + MBP < / td > < td > 6642年< br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> FGFR2引物:管外伸部分为小写。匹配FGFR2的序列用大写。< br / > pSpeedET-R2: cctcgagtgaagaacc TTCCTCATTGGTTGTGAGAGTGAGAATTCG;< br / > MBP-F: ctgtacttccagggc accacattagagagaagaggagcac < br / >
管退火反应,使用20 ng的向量和20 ng的纯化PCR产品包含FGFR2 ECD + TM序列共有4μl在室温下10分钟。在此期间，FGFR序列和载体(带有MBP)的悬垂物将一起退火，生成带有FGFR序列和麦芽糖结合蛋白的重组质粒。采用MBP作为融合标记，增加了构建物的溶解度，并在Western blot分析中进行蛋白鉴定。由于FGFR序列包含疏水跨膜结构域，其目的是在整个表达研究中保持跨膜结构域的完整性，因此使用MBP是必要的(图1和图2)。< br / > < br / > 图1 。pSpeedET质粒中的FGFR结构。 TEV蛋白酶裂解位点位于FGFR2结构正向引物的悬挑处。< br / > < br / > 图2 。聚合酶不完全引物延伸(管)克隆工艺 < br / >
1. 转化为clonon—在管道退火后立即转化为E。杆菌 DH5α细胞克隆
  1. 解冻1瓶DH5 ?冰又是主管细胞;
  2. 加上2μl管反应的细胞和孵化冰上10分钟只
  3. 将细胞在42℃下加热30秒，然后将细胞放回冰上2分钟。
  4. 增加500μl SOC复苏的媒体(RT)的细胞并将其设置为一个37°C瓶一小时只
  5. 传播100转换的μl磅+卡那霉素盘子和孵化在一夜之间37°C。卡那霉素的最终浓度是在50岁? g / ml。
2. 菌落聚合酶链反应，DNA提取和测序-通过菌落PCR和测序的大小和序列验证管道克隆的成功
  1. 用吸管提示选择一个殖民地,resuspend 13.7μl nuclease-free水(水的体积需要25μl PCR反应)。
  2. 添加13.7 ? l水,2.5 ? 2.5毫米的l核苷酸,2.5 ? l 2毫米的底漆,2.5 ? l 2 ? M反向引物,0.3 ? l e2TAK聚合酶(豆类生物)和5 ? l聚合酶5 x缓冲区。热循环条件如下:94°C持续6分钟，然后是35个循环，94°C持续30秒，50°C持续30秒，72°C持续2分钟，最后是72°C持续10分钟，然后是4°C的保温周期。
  3. 在1%琼脂糖凝胶上运行，以确定预期插入物的大小。
  4. 选择的菌落在3ml LB +卡那霉素中，37℃，摇瓶中，230 rpm, 5ml培养管中过夜。
  5. 使用通用电气医疗保健插图质粒制备微型自旋试剂盒分离重组质粒。
  6. 通过测序确定结构的存在性和准确性。
  7. 用ApE程序进行核苷酸分析和BLASTn比对，验证序列是否正确。< br / > < br / >
FGFR2结构的大规模表达
1. Lemo21 DE3细胞蛋白表达的转化与接种
  1. 使用上述方案(步骤A2)，积极选择使用LB +卡那霉素琼脂板。
  2. 一夜之间选择了殖民地和成长之间12 h和16 h与50磅的100毫升μg /毫升卡那霉素+ 25μg /毫升氯霉素又是;
  3. 16小时后,准备接种:100毫升一夜之间文化、卡那霉素100μg /毫升、氯霉素50μg /毫升、0.5毫米L-rhamnose, 2毫米MgSO <子> 4 < /订阅>。< br / > 注意:试剂的浓度是基于1000毫升极好的肉汤(TB)的体积。
  4. 将接种的结核培养物和抗生素置于37℃的摇瓶中。当OD600接近0.6时监视它。当培养物达到OD600 0.4-0.5时，将摇瓶内的细胞冷却至18℃，以减缓细胞生长。< br / > 注:OD值每10分钟检查一次，30-45分钟细菌培养达到OD = 0.6
  5. 取各构建物培养物1 ml作为阴性对照，用于后续实验。此外,甘油股票(50 ? l 50%甘油ddH <子> 2 < /订阅> O和50 ? l(文化)用于归档。将甘油储存在-80°C。甘油应该是无菌的。
  6. 将最终浓度为0.1 mM的异丙基- d -1-硫代半乳糖苷(IPTG)添加到每个培养物中，诱导表达。
  7. 18°C, 230 rpm，在摇床中孵育过夜。
  8. 次日取细胞如下:4℃，4000 x g离心培养10 min。
  9. 将上清弃，用100毫升4°C裂解液(配方1)对小球进行复苏清洗。
  10. 再次以4000 x g离心10 min，弃去裂解液。
2. 溶解细胞
  1. 将诱导后的Lemo21细胞在40 ml裂解缓冲液中复苏，并上下旋转管道，以确保在50 ml锥形管中均匀。这一切都必须在冰上进行。
  2. 加1μl 2000 U /毫升DNase我1μM CaCl <子> 2 < /订阅>,和蛋白酶抑制剂(1毫米苯甲脒1毫米PMSF 1μM e - 64, 0.5毫米TCEP, 1μM抑肽素,和1μM bestatin)裂解缓冲消散之前,声波降解法只
  3. 用细胞。超声条件:6次循环;1周期:超声20秒后关闭40秒。
  4. 超声处理后，将悬浮液置于重型离心管中，用JA20转杯离心48384 x g，离心30分钟。< br / > 注:可选停止点。理想情况下，如果这个过程继续下去，效果会更好。 < br / > < br / >
洗涤剂提取
1. 准备一个裂解缓冲,包括1% n-dodecylβ-D-maltoside (DDM)洗涤剂。
2. 每100μg细胞颗粒或100μl上层清液,加500μl 1%的洗涤剂溶液和resuspend PMSF。
3. 在4°C条件下，将悬架翻转2小时。
4. 离心悬浮液23,708 x g， 4℃15分钟。
5. 将上清液和细胞颗粒分离，并在-80℃保存。(细胞颗粒和上清液均应含有FGFR2，但细胞颗粒应含有更多FGFR2)。< br / > < br / >
通过NuSep 8-16%三甘氨酸凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测样品，以确定是否存在感兴趣的蛋白
1. Resuspend 300年小球μl MilliQ水和100μl 4 x加载染料β-mercaptoethanol (BME),而100年μl加载相同的染料添加到300年μl上层清液/部分细胞颗粒又是;
2. 离心23,708 x g 10分钟，准备装入聚丙烯酰胺凝胶中。< br / > 注:步骤C1和C2为确保加载的样品黏性不太好进行电泳。
3. 负载样品(每)20μl梯子和运行在200 V大约45分钟。
4. 运行两个凝胶，以便其中一个可以染色，另一个可以用于Western blotting。< br / > < br / >
Western blot和抗体检测采用抗mbp单克隆抗体HRP偶联
1. 使用VWR Amresco®缓冲液对感兴趣的凝胶进行Western blot。
2. 将三缩水甘氨酸凝胶浸泡在Amresco快速转移缓冲液中10分钟，用足够的缓冲液覆盖整个凝胶。
3. PVDF膜在甲醇中浸泡30秒，然后在水中浸泡5分钟，最后在快速转移缓冲液中浸泡，直至不再漂浮。使用足够的溶液覆盖薄膜。
4. 根据Amresco的湿传输协议组装西部块堆栈。
5. 将叠置物与Amresco快速转移缓冲液置于凝胶电泳室中，以75 V运行20 min，快速转移缓冲液必须充满到电泳室顶部，使叠置物完全浸入缓冲液中。
6. 拆下叠片，在Amresco RapidBlockTM溶液中孵育5 min。
7. 将PVDF膜在20 ml的封闭缓冲液中室温孵育1小时。
8. 孵化20毫升的PVDF膜阻断缓冲区10μl anti-MBP单克隆抗体(合共轭)来自新英格兰在4°C又是一夜之间生物学实验室;
9. 第二天，用25毫升TBST(配方2)冲洗PVDF膜三次，每次5分钟。
10. 使用KPL TMB膜过氧化物酶底物系统试剂盒检测蛋白的存在。反应所需的体积列在试剂盒说明书中。< br / > ,,< br / >
通过透析重新折叠FGFR2
1. 洗涤夹杂物用0.5%胍-盐酸复苏微丸(体积刚好够使微丸均匀复苏)，4℃下4000 x g离心20 min。冲洗后，夹杂物应呈无色外观。
2. FGFR重组蛋白的增溶和变性
  1. 将原始包涵体变性并溶解在10ml透析液#1(配方3)中。
  2. 为便于溶解，将细胞颗粒和透析液混合物在水浴中暂时加热至40°C，然后轻轻涡旋。溶液应该无色透明。在40℃条件下，透析前将混合物孵育30- 40min。
3. 设备组装及孵化
  1. 将透析液#1中溶解的包涵体装入带夹的蛇皮膜中。
  2. 将填满的膜悬挂在装有700毫升透析液#2(配方4)的容器中。
  3. 将设备放置在寒冷的房间(4°C)，用磁力搅拌棒持续搅拌一夜。
  4. 次日将蛇皮样品放入重型离心管中，48384 x g离心30 min，将颗粒与上清分离，-80℃保存。感兴趣的蛋白质在上清液中。
< br / >
通过肝素结合色谱纯化和功能测试
1. 为了测试分离并开始测试FGFR2的功能，使用1ml HiTrapTM肝素亲和层析柱(GE Healthcare)和注射泵。
< br / > 注:GE Healthcare提供了如何使用该列的说明。下面是这个过程的附加细节。 < br / >
1. 用注射器将10个结合缓冲液(配方5)柱体积(CVs)装入柱上，以1ml /min的速度使柱平衡。1 CV = 1 ml
2. 注射器将FGFR2上清液从透析中过滤，以防止堵塞，并将其装载到柱上。< br / > 注意:确保没有气泡进入柱内。
3. 将FGFR2上清液装入色谱柱。
4. 用5 CVs的装订缓冲液清洗任何杂物。
5. 运行10 CVs洗脱缓冲液(配方6)。使用无菌1.5 ml离心管收集所有流经、清洗和洗脱的部分。加载和运行速度为1ml /min。每个馏分的体积应为1ml。1cv = 1ml。
6. 运行PAGE和Western Blot分析以确认FGFR2的分离。对于Western blotting，使用新英格兰生物抗体的抗mbp hrp偶联抗体检测FGFR2。
7. 将纯化的FGFR2与FGF1、肝素和FGFR2联用，运行大小排除色谱(SEC)，以验证二聚作用。然后用抗mbp抗体对SEC洗脱部分进行Western blotting，以确定洗脱复合物的大小。
指出:
1. 测试功能的第一步是确定FGFR2是否能够与肝素和FGF1结合。这一步是必不可少的，因为肝素和FGF1结合是三元复合物形成和二聚的必要步骤。为此，重复上述步骤F，同时从SEC中加载1ml FGF1的洗脱液，然后在步骤F2和F3之间加载10 CVs (10ml)的绑定缓冲液(图3)。
2. 关键注释已经包含在整个协议的重要步骤中。总的来说，这是一个漫长的过程，几乎没有停止点。另外，我们还介绍了如何表达、分离和纯化FGF1来测试FGFR2功能。 < br / > < br / > 图3 。Western blot结果显示，FGFR2 + MBP构建物(红色矩形)从HiTrap肝素亲和层析中洗脱，显示重组蛋白与肝素结合的能力。 Lane 1:蛋白标准。泳道2-3:冲洗馏分。泳道4-5:洗脱分数。< br / > < br / > 图4 。尺寸排除色谱剖面。洗脱分数为红色，范围为A9-12，其次为B12-B7。洗脱组分A11和A12对应于含有ECD + TM结构域的非活性FGFR2。洗脱分数B11对应含有ECD + TM结构域的FGFR2。洗脱分数B11-B8对应于FGF1。每个洗脱分数的体积为1 ml. < br / >

Part II: FGF1表达纯化 < br / >

FGF1表达式
1. 变换使用FGF1 DH5α细胞表达载体在pMCSG7 DNASU质粒库。克隆方法与A2步骤相同，但选择卡贝尼西林代替卡那霉素作为选择标记。
2. 殖民地成长3毫升和100磅? g / ml羧苄青霉素一夜之间只
3. 使用GE Healthcare illustration质粒准备小型自旋试剂盒从培养物中分离DNA。
4. 使用T7正向和反向引物确认FGF1序列。
5. 大规模表达
  1. 将FGF1表达质粒转化为活性E。大肠杆菌 Lemo21 (DE3)细胞，与卡苄青霉素呈阳性选择。
  2. 取一个菌落，用氯霉素和卡宾西林在100毫升的LB中培养过夜。
  3. 第二天,使用这种文化接种1000毫升的结核病100μg /毫升羧苄青霉素,氯霉素50μg /毫升、0.5毫米鼠李糖,和2毫米MgSO 4 <子> < /订阅>以下步骤B1c又是以上;
  4. 如上文B2步骤所述，在4℃条件下继续细胞采集、超声裂解和超离心。蛋白质会在上清液中。
< br / >
FGF1净化< br / > 注:使用1ml HiTrap纯化FGF1 TM柱(GE Healthcare)用注射器。
1. 在注射器中注入1ml的结合缓冲液，该结合缓冲液与用于大规模表达FGFR2的裂解缓冲液相同。确保注射器内的气泡已排出，将相同的裂解液以1ml /min的速度通过柱。
2. 在到达注射器末端之前，再用绑扎缓冲液填充注射器，再次推入注射器。这是用9个CVs来平衡色谱柱。
3. 使用注射器将整个FGF1样品(超离心上清)在柱中运行。
4. 用10 CVs(总计10 ml)裂解缓冲液洗涤柱，以洗脱任何可能与FGF1和肝素非特异性结合的污染蛋白。
5. 用洗脱缓冲液洗脱FGF1(配方7)。
6. 按照上述步骤C和步骤D中讨论的方法，通过PAGE和Western blot分析来判断纯化是否成功，但是我们没有使用anti-MBP antibody (HRP偶联)，而是使用Pierce的anti-His antibody (HRP偶联)。
7. 利用大小排除色谱(SEC)进一步纯化蛋白质。2毫升的洗脱加载到列(这是允许的最大体积和浓度决定接受后续功能实验FGFR: 1.756μg /毫升)。用于尺寸排除色谱(SEC)的运行缓冲液(配方8)为25mm HEPES、0.1% DDM和150mm NaCl, pH 7.5。

食谱

裂解缓冲< br / > 300mm NaCl pH 7.5 时50mm HEPES 0.1 mM MgSO4 5%甘油
TBST < br / > 20mm Tris-HCl pH 7.5 NaCl 0.1%渐变20
变性缓冲透析液#1 6m盐酸胍 DDM < br / > 0.1% 10mm DTT 1μM蛋白酶抑制剂e - 64 < br / > 1mm苯扎脒 1mm PMSF 1μM bestatin < br / > 1μM抑肽素在pH值8.0
透析液#2 25mm HEPES NaCl 10%甘油< br / > 1mm l -半胱氨酸pH 7.5
肝素亲和层析结合缓冲液 NaCl 25mm HEPES 1mm苯扎脒 pH为7.5时，滴滴涕浓度为0.1%
肝素亲和层析洗脱缓冲液 25mm HEPES 1.5 M NaCl DDM < br / > 0.1% 1mm苯扎脒 1mm PMSF, pH 7.5
FGF1 的洗脱缓冲液 1.0 M NaCl 10%甘油< br / > 25mm HEPES 10mm咪唑 1mm苯扎脒pH 7.5
正在为SEC 运行缓冲区 25mm HEPES DDM < br / > 0.1% 150mm NaCl, pH 7.5
阻断缓冲区< br / > 5%奶粉 TBST < br / >

致谢

该项目由美国国家科学基金会职业奖1350555 (HLN)、夏威夷大学马诺阿分校和夏威夷大学本科生研究机会项目(AB)资助。

相互竞争的利益

答:没有相互竞争的利益需要披露。HLN:没有相互竞争的利益需要披露。

参考文献

陈,p . H。， Unger, V. and He, X.(2015)。< a href = " https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26463591 " target = "平等" >结构完整的人类PDGFRβ绑定到其激活配体PDGF-B由negative-stain电子显微镜。 J Mol Biol 427(24): 3921-3934。
Dessau, m.a.和Modis, Y.(2011)。蛋白结晶用于x射线结晶学。 J Vis Exp(47)。
Klock, H. E.和Lesley, S. A.(2009)。聚合酶不完全引物延伸(PIPE)方法应用于高通量克隆和定点诱变。方法Mol Biol 498: 91-103。
Klock纽约,h·E。，科斯马，E. J。， Knuth, m.w.和Lesley, s.a.(2008)。 protein 71(2): 982-994。
陆,C。， Mi, L. Z。Schurpf, T。， Walz, T.和施普林格，T. A.(2012)。机制激酶介导的表皮生长因子受体二聚体。jbiol Chem 287(45): 38244-38253。
Mi, l . Z。，格雷，m.j.。Nishida, N。,"魁地奇"大赛T。， Lu, C.和施普林格，T. A.(2008)。在洗涤剂胶束和磷脂纳米圆盘中的功能和结构稳定性。生物化学 47(39): 10314-10323。
Mi, l . Z。陆,C。李,Z。Nishida, N。， Walz, T.和施普林格，T. A.(2011)。同时显示表皮生长因子受体的胞外和胞质结构域。Nat Struct Mol Biol 18(9): 984-989。
穆罕默迪,M。施莱辛格、J.和哈伯德(1996)。结构的FGF受体酪氨酸激酶域揭示了一种新的自抑制机制。 Cell 86(4): 577-587。
Opatowsky Y。宽松的,我。多美,F。Bleichert F。， Unger, V. M.和Schlessinger, J.(2014)。结构、结构域组织和干细胞因子诱导的完整试剂盒二聚体的不同构象状态。 Proc Natl Acad Sci U S a 111(5): 1772-1777。
Paavilainen, S。格兰迪，D。Karelehto, E。张，E。，苏西，P。Erdjument-Bromage, H。， Nikolov, D.和Himanen, J.(2013)。高度表达一个完整的Eph接待员。 Protein Expr Purif 92(1): 112-118。
普罗尼科夫，a.n。哈伯德，s.r.。， Schlessinger, J. and Mohammadi, M.(2000)。水晶结构的两个复杂的FGF-FGFR功能的决定者。 Cell 101(4): 413-424。
普罗尼科夫，a.n。施莱辛格，J。，哈伯德，S. R.和穆罕默德，M.(1999)。< a href = " https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10490103 " target = " _blank " > Structural FGF的基础receptor dimerization and activation。 Cell 98(5): 641-650。
Rosano, g.l.和Ceccarelli, e.a. (2014a)。 microbial系统中的蛋白质表达。前面微生物 5: 341。
罗萨诺，g.l.和切卡雷利，e.a. (2014b)。 >重组蛋白质在大肠杆菌中的表达:advances和challenges。前微生物 5: 172。
Schlessinger, J。普罗尼科夫，a.n。易卜拉欣，O。Eliseenkova, a.v.。是的，b.k.。是的，A。，林哈特，r.j.和穆罕默德，M.(2000)。目标=“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”“目标=”< / > Mol Cell 6 (3): 743-750。
特纳，N.和Grose, R.(2010)。Fibroblast成长因子签名:从发展到癌症。 Nat Rev Cancer 10(2): 116-129。
是的，b.k.。Eliseenkova, a.v.。普罗尼科夫，a.n。绿色，D。平内尔，J。波拉特，T。,Gritli-Linde, A。，林哈特，r.j.和穆罕默德，M.(2002)。结构性基础，以激活octasulfa的纤维化生长因子符号。 Mol Cell Biol 22(20): 7184-7192。
张,F .张，Z。林，X。,Beenken, A。,V Eliseenkova, A。。，穆罕默德，M.和林哈特，r.j.(2009)。< / > Biochemistry 48 (35): 8379-8386。
Babina,特纳。和,第C .(年)。目标FGFR癌症的突破和挑战。< / > Nat Rev癌症 17 (5): 318-332
罗宾，n.h.。,福克,M。J。，霍尔德曼-恩格勒特，c.r.(1993)。 fgfr -相关Craniosynostosis Syndromes。 < / >:亚当,M。P。,H Ardinger, H .。R, Pagon, A。 et al . (eds) GeneReviews ((R))。西雅图(WA)。< / br / >