材料和试剂

移液器吸头（例如，0.1-10μl，Daslab，目录号：162222;5-200μl，Daslab，目录号：200024;和100-1,000μl，Daslab，目录号：162001）
注射器1毫升（BD Pastipak，目录号：303173）
针21 G x 1“（Terumo，目录号：AN * 2125R1）
1.5毫升和2毫升Eppendorf管（例如，Sarstedt，目录号：72.695.500和72.690.000）＆nbsp;
JJN3细胞系（DMSZ，目录号：ACC-541）
抗GAPDH抗体（Cell Signaling，目录号：12118），储存于-20°C
抗aiolos抗体（Cell Signaling，目录号：12720），储存于-20°C
DNA / RNA Allprep，包括RLT +缓冲液（QIAGEN，目录号：80204），在RT存储
丙酮（Merck，目录号：1000141011），在RT存储
NaCl（Merck，目录号：1064041000），在RT存储
乙醇（Merck，目录号：1009832511），在RT存储
NaOH（Merck，目录号：1064981000），在RT存储
SDS（Merck，目录号：8220501000），在RT存储
Tris-Base（默克，目录号：648310-500GM），在RT存储
蛋白酶抑制剂（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc29130）
抗兔检测模块，包括Luminol-S，过氧化物，抗体稀释液2，抗兔二抗，链霉抗生物素蛋白-HRP（ProteinSimple，Biotechne，目录号：DM-001），储存于4°C
12-230 kDa Wes分离模块，8 x 25毛细管柱（ProteinSimple，Biotechne，目录号：SM-W004），在RT存储
RIPA缓冲系统（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-24948）
DMSO中的PMSF溶液，200 mM（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-482875）
SodProteium原钒酸盐在水中，100 mM（New England Biolabs，目录号：P0758）＆nbsp;
UltraCruz ®蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-29130）
去离子水
DTT（Promega，目录号：V3155），储存于-20°C
乙醇70％（见食谱）
5 M NaCl（参见食谱）
0.2 M NaOH（见食谱）
1 M Tris，pH 6.8（参见食谱）
蛋白酶抑制剂（见食谱）
样品缓冲液（见食谱）

设备

移液器（需要的体积 - 10μl，2-20μl，10-200μl和100-1,000μl）
WES TM （ProteinSimple，Biotechne，目录号：004-600）
用于微管的离心机（Eppendorf，型号：5415R）
冷柜-80°C（三洋，型号：Vip系列86）
冷藏室-20°C
Thermoblock（Grant，目录号：QB02）
Vortex（VWR，目录号：1444-1372）
台式离心机（VWR，Galaxy MiniStar）
用板式适配器离心（Eppendorf，型号：5810R）

软件

指南针 TM （Protein Simple，San Diego，CA，USA， https：// www .proteinsimple.com / software_compass_simplewestern.html ）＆NBSP;
Excel（微软）

程序

蛋白质提取
该程序的方案如图1所示。
1. 在一个1.5ml Eppendorf管中收集5×10 5个 -5×10 6 细胞。＆nbsp;
2. 在室温下以1,200 x g 离心3分钟。
3. 倒出上清液，用1 ml PBS洗涤。＆nbsp;
4. 在室温下以1,200 x g 离心3分钟。
5. 倒出上清液
6. 重悬于350μlRLT+。＆nbsp;
7. 储存在-80°C，细胞可在那里保存数年。
8. 在室温下解冻细胞。
9. 将细胞悬液通过注射器和针头8次。
10. 在台式离心机中以最大速度旋转5秒以消除泡沫。
11. 按照 QIAGEN Allprep协议提取DNA和RNA。将样品通过DNA柱，按照程序将乙醇加入流通液中，并将样品通过RNA柱。洗脱液是蛋白质样品。在该方案中，使用来自RNA柱的第一次流出物（约600-700μl体积）。＆nbsp;
12. 向先前制备的每2ml Eppendorf管中加入3.3μl5MNaCl。
13. 将来自RNA柱的一半通流从前一点添加到每个管中（每个Eppendorf管300-350μl样品）。
14. 从上一步骤（约1,200μl）向每2 ml Eppendorf中加入4倍体积的冰冷丙酮。
  注意：丙酮的温度非常重要。将其置于-20°C至少过夜。
15. 通过倒置混合3次并立即放在冰上直至储存。
16. 储存在-20°C，至少过夜。
17. 在4℃下以16,000 x g 离心30分钟。＆nbsp;
18. 小心地倒出上清液。
图1.从RLT +缓冲液中提取蛋白质的程序方案。有关详细说明，请参阅程序A.
1. 在管中加入70％乙醇（冰冷）洗涤，通过倒置混合3次。没有必要涡旋。
2. 在4℃下以16,000 x g 离心10分钟，倾析上清液。
3. 用乙醇重复洗涤。
4. 小心地倒出乙醇而不会丢失颗粒，此时颗粒可能是透明的。
5. 风干颗粒在37℃，30分钟（时间取决于剩余的乙醇量）。此时重要的是不要过度干燥蛋白质颗粒，因为它会变得不可溶。
6. 将蛋白质在50μl0.2MNaOH中再水化，在室温下放置10分钟，不时小心地涡旋，避免将颗粒移动到管的上部。
7. 加入150μl含有DTT（最终DTT浓度50mM）和蛋白酶 - 磷酸酶抑制剂（10μlPMSF溶液，10μl原钒酸钠溶液和10μl蛋白酶抑制剂混合溶液/ ml）的样品缓冲液。至少留15分钟溶解蛋白质。体积和时间取决于颗粒。可以涡旋或混合。
8. 在95°C下煮沸样品5分钟。
9. 冷却至室温。样品可以在-20°C或-80°C下保存（推荐）。
  注意：当样品解冻用于后续应用时，可能会发生一些沉淀。在这种情况下，将样品混合均匀，或在热块中加热至35°C，保持30-60分钟。
用于分析的样品的制备
注意：以下程序适用于总蛋白质分析（TPA）以及毛细管纳米免疫分析（CNIA）的样品制备。
1. 根据制造商的程序准备5x Master Mix。它包含1 kDa，29 kDa和230 kDa荧光标准品。除去离子水外的所有试剂均在Wes Separation Module中提供。
  1. 打开标准包翻盖。
  2. 用DTT刺穿透明管的箔，加入40μl去离子水，轻轻混合。
  3. 刺穿粉红色管的箔，加入20μl10x样品缓冲液和20μl步骤B1b的DTT溶液，轻轻混合。
2. 通过刺穿白色管的箔并添加20μl去离子水来制备生物素化的梯子（包括在Wes分离模块中）。轻轻混合并转移至1.5ml Eppendorf管中。
3. 在新的1.5 ml Eppendorf管中准备3μl每种样品进行定量。
  注意：在TPA测定中不经稀释分析样品。如果CNIA在去离子水中或在Wes Separation Module试剂盒中提供的0.1x样品缓冲液中稀释它们。对于CNIA，样品的最终浓度应为0.2 mg / ml。
4. 将0.75μl的5x主混合物添加到在前一步骤中制备的每个管中。
5. 通过移液混合。
6. 通过以最大速度旋转5秒来收集样品。
7. 将热块预热至95°C。将待分析的标准品和样品放入热块中。在95°C加热5分钟。
8. 在替补席上冷静到RT。
总蛋白质定量
在该测定中，所有蛋白质都被生物素化并用链霉抗生物素蛋白-HRP化学发光检测基质。
1. 根据图2使用Compass软件制备测定模板。
  1. 运行Compass软件并创建新的检测（文件→新检测→WES→大小类型：总蛋白分析→大小范围12-230 kDa→药筒25）。＆nbsp;
  2. 在第一行标注样本。＆nbsp;
  3. 保存化验。
  图2.使用标准曲线和18个未知蛋白质含量样本的总蛋白质测定的测定模板。每个样品的推荐体积和每个孔中的试剂用箭头标记。行对应于：（A）样品，（B）总蛋白质生物素标记试剂，（C）抗体稀释剂，（D）总蛋白质链霉抗生物素蛋白HRP，（E）鲁米诺/过氧化物酶。行（A）中的第一个孔含有生物素化的梯子，并且在行（B）中含有抗体稀释剂。
2. 使用通过常规蛋白质提取用RIPA缓冲液提取的细胞系样品制备标准曲线样品（标准方案的实例 https://www.abcam.com/protocols/sample-preparation-for-western-blot ）。这里，使用JJN3细胞系（5×10 6 细胞）。标准曲线应使用浓度为0.25mg / ml，0.125mg / ml，0.0625mg / ml，0.03125mg / ml，0.0156mg / ml和0mg / ml的5个连续稀释液制备。将它们与程序B中的主混合物混合。
3. 准备蛋白质标记试剂;在使用前将重构试剂1和2带到RT并遵循生产者协议。
4. 通过在1.5ml Eppendorf管中混合200μlLuminol-S和200μl过氧化物酶制备化学发光底物，两者均在检测模块中提供。
5. 从板上取下箔的上部，并按照步骤C1中设计的模板移液板;根据分离模块小叶添加洗涤缓冲液。
6. 在室温下以1,100 x g 离心10分钟，以除去任何气泡。检查是否存在气泡，如果仍存在气泡则用针捏住气泡。确保离心机设置在室温（18-25°C）。
7. 打开WES机器。将带有毛细管的墨盒（包含在Wes Separation Module中）插入WES机器的墨盒支架中。支架内的灯应从橙色变为蓝色。
8. 从板上取下箔的下部并将其放入WES机器内。关闭机器并单击指南针中的开始按钮。＆nbsp;
9. 完成运行后，检索数据并根据数据分析点1进行分析，计算每个样品中的蛋白质浓度。
抗体优化
该步骤包括在四种抗体稀释度（1/25; 1/50; 1/100和1/200）下以0.2mg / ml的浓度在细胞系样品中进行测定。在该示例中，显示了两种抗体，抗GAPDH和抗Aiolos，并且板布局的示例在图3中示出。

图3.抗aiolos和抗GAPDH抗体优化的平板布局。行对应于：（A）样品，（B）不同稀释度的抗体稀释剂（C）抗体（1/25至1/40），（D）二抗（E）鲁米诺/过氧化物酶。行（A）中的第一个孔含有生物素化的梯子，行（B）和（C）抗体稀释剂和行（D）链霉抗生物素蛋白HRP。
1. 根据图3使用Compass软件创建新的化验模板。＆nbsp;
2. 运行Compass软件并创建新的检测（文件→新检测→WES→尺寸类型：尺寸→尺寸范围12-230 kDa→墨盒25）。＆nbsp;
3. 通过连续稀释法制备抗体稀释液中的抗体，每孔中稀释的抗体体积为8μl。＆nbsp;
4. 根据制备的模板移液板，如步骤C4-C8所示进一步进行。每个孔中的标准体积为：样品3μl;抗体稀释液，一抗和二抗各8μl;鲁米诺/过氧化物酶溶液15μl。＆nbsp;
5. 根据数据分析中的第2点分析结果。
6. 绘制峰面积与抗体稀释度，并找出曲线遵循线性趋势线的最后抗体浓度，这意味着达到了抗体饱和度，如图4中的示例所示，其中两种情况下稀释度均为1/100被认为是最佳的。
  
  图4.抗aiolos和抗GAPDH抗体优化的结果。箭头表示所选的抗体稀释度。
7. 需要为每种蛋白质生成标准曲线，以评估每种蛋白质的表达可以量化的线性范围。 Haematologica提供了标准曲线示例的详细信息“通过毛细管优化蛋白质定量使用免疫测定的纳米电泳“Misiewicz-Krzeminska 等的截面和图3（2018）。
使用预先设定的抗体稀释度进行样品中蛋白质水平的定量分析注意：通常建议在同一次运行中测量目标蛋白质和参考蛋白质的水平。
1. 准备样品以分析目标蛋白质和参考蛋白质。在该实施例中，分析一种感兴趣的蛋白质并且一次参考，因此在一次运行中评估12个样品。混合8μl样品和2μlMasterMix（当准备样品一次进行多次测量时，加入10％过量的样品和主混合物）。继续执行程序B中所述。＆nbsp;
2. 要分析数据，请按照数据分析部分的第2点进行操作。

数据分析

每次运行后，检查荧光标准位置并根据需要进行调整，如图4所示。确保所有标准位置在所有毛细管中都是正确的。要调整荧光标准，请用鼠标指向该位置，单击右键并选择“强制标准”选项。
注意：系统使用荧光标准物的位置将分子量分配给检测到的峰。如果分析的样品含有SDS或溴酚蓝，则出现荧光标准1kDa之前的强峰，并被系统检测为假阳性1kDa荧光标准品。在这种情况下，有必要纠正荧光标准1 kDa位置，使用生物素化阶梯中检测到的位置（图5）。

图5.荧光标准品在样品分析中的正确位置（1,29和230 kDa）。上图对应于生物素化阶梯，两个下图对应于MM样品。
TPA分析可以在Haematologica，图2中找到。（参见 http：//www.haematologica。组织/内容/ 103 /八百八分之五）
1. 要生成标准曲线，请通过选择“毛细管”选项，复制包含标准曲线样品的毛细管曲线下的总面积。要将数据复制到Excel，请按鼠标右键并选择“复制”选项。
2. 绘制每个样品中总面积与蛋白质已知浓度的关系图。在Excel中生成等式。
3. 使用每个样品的总面积作为“x”变量，从等式计算分析样品中的浓度。
CNIA分析：样品中蛋白质表达水平。
1. 用蛋白质名称和分子量命名峰（例如，aiolos，85 kDa GAPDH，42 kDa）。要命名峰值，请选择“编辑”→“分析”→“峰值名称”选项。＆nbsp;
2. 检查每个蛋白质峰的每个毛细管的结果中的信噪比（S / N）。
  注意：能够量化它应该在10以上。如果实验验证证明具有较低S / N比的信号线性，则可以降低定量限。
3. 检查化学发光是否没有负值，如果发生这种情况，则无法量化样品。这意味着信号太高，化学发光底物全部被HRP消耗。
4. 该区域对应于评估的蛋白质水平。＆nbsp;
5. 要使用GAPDH标准化数据，请使用公式，如示例所示：
6. 结果可视化为峰（图5A），虚拟印迹（图5B）和公式结果（图6C）。
  
  图6. MM样品中aiolos和GAPDH定量的结果 A.指定峰和峰分析结果，包括面积和s / n比。 B.结果的虚拟印迹可视化。 C.对GAPDH蛋白标准化的aiolos水平的定量结果。
注意：“通过毛细管纳米电泳和免疫测定优化蛋白质定量”部分和论文图3中提供了检测设置限制的详细信息（Misiewicz-Krzeminska 等。，2018）。

笔记

在使用相同抗体通过相同样品的至少3次重复评估每组样品之前，应检查测定的可变性。在我们之前的研究中，我们报告的变异性在5.8％和15.5％之间（Misiewicz-Krzeminska et al。，2018）。
应考虑适当的阳性和阴性对照。作为阴性对照，应当使用先前描述的缺乏测试蛋白质表达的细胞，相反作为具有所述蛋白质表达的阳性对照细胞。要搜索适当的阴性和阳性对照，请搜索文献数据，或参考抗体传单。＆nbsp;
温度是测定中的关键点。确保工作环境的标准室温保持在18-25°C。

食谱

乙醇70％
用15ml去离子水稀释35ml乙醇，倒置几次混合
5 M NaCl
将175.3g NaCl溶于600ml蒸馏水中
0.2M NaOH
1. 通过将40g NaOH溶解在200ml去离子水中制备5M NaOH 注意：戴上手套和实验室外套保护。
2. 稀释至0.2M NaOH：2ml 5M NaOH和48ml去离子水
1 M Tris pH 6.8
将30.29克Tris-Base溶于200毫升去离子水中将pH调节至6.8，然后将体积调节至250 ml
需要约20毫升浓HCl
蛋白酶抑制剂
将一片溶于2ml去离子水中
样本缓冲区
1. 将20毫升Tris（pH 6.8,1M），8克SDS，50毫克溴酚蓝，40毫升甘油和100毫升混合至100毫升
2. 称取7.7mg DTT并溶于上述步骤的1ml缓冲液中
3. 加入10μl蛋白酶抑制剂，10μlPMSF溶液和10μl原钒酸钠溶液
4. 好好混合

致谢

作者要感谢Patryk Krzeminski对图形的帮助。图1. IMK得到了“SociedadEspañoladeHematologíayHemoterapia”的支持。这项研究得到了国际骨髓瘤基金会黑天鹅研究计划®，“Gerencia Regional de Salud，Junta de CastillayLeón”（BIO / SA35 / 14）和项目“PI16 /”的资助。 01074“来自ISCIII（由FEDER共同资助）。由于INNOCAMPUS计划（CEI10-1-0010），获得了WES TM 平台。
＆NBSP; Misiewicz-Krzeminska 等（2018）提供了临床样本分析的详细信息。该程序也已在Quiwaider 等人（2017）中使用。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

伦理

所有患者均按照赫尔辛基宣言和萨拉曼卡大学医院伦理委员会的批准进行了书面知情同意。

参考

Chomczynski，P。（1993）。从细胞和组织样本中一步同时分离RNA，DNA和蛋白质的试剂。 Biotechniques 15（3）：532-534,536-537。
Mathieson，W。和Thomas，G。A.（2013）。使用试剂盒同时提取DNA，RNA和蛋白质：样品数量或质量是否有偏见？ Anal Biochem 433（1）：10-18。
Misiewicz-Krzeminska，I.，Corchete，LA，Rojas，EA，Martinez-Lopez，J.，Garcia-Sanz，R.，Oriol，A.，Blade，J.，Lahuerta，JJ，Miguel，JS，Mateos，MV和北卡罗来纳州古铁雷斯（2018年）。一种新的纳米免疫分析方法，用于定量CD138纯化的骨髓瘤细胞中的蛋白质：生物学和临床应用。 Haematologica 103（5）：880-889。
Quwaider，D.，Corchete，LA，Misiewicz-Krzeminska，I.，Sarasquete，ME，Perez，JJ，Krzeminski，P.，Puig，N.，Mateos，MV，Garcia-Sanz，R.，Herrero，AB and Gutierrez ，NC（2017）。 DEPTOR维持浆细胞分化并有利于影响多发性骨髓瘤的预后。 J Hematol Oncol 10（1）：92。
Vorreiter，F.，Richter，S.，Peter，M.，Baumann，S.，von Bergen，M。和Tomm，J.M。（2016）。同时提取DNA，RNA，蛋白质和代谢物的方法的比较和优化。 Anal Biochem 508：25-33。