材料和试剂

Falcon 100 mm细胞培养皿（Corning，目录号：353003）
盘子35毫米（康宁，目录号：353001）
纸巾Scott C-fold（Uline，目录号：560801）
BD 1 ml胰岛素注射器（Fisher Scientific，目录号：22-253-260）
巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20D）
微量离心管，1.5 ml（Fisher Scientific，目录号：0548129）
聚丙烯离心管，15 ml（Fisher Scientific，目录号：22-010-076）
聚丙烯离心管，50 ml（Fisher Scientific，目录号：05-539-6）
螺纹小瓶，玻璃4 ml，琥珀色（Thermo Fisher Scientific，目录号：C4015-2W）
螺纹小瓶，玻璃4 ml，透明（Thermo Fisher Scientific，目录号：C4015-21）
LVI TM （低容量插入物）小瓶，0.3 ml，琥珀色玻璃（Wheaton，目录号：225328）
用于荧光测量的96孔黑色平底聚苯乙烯微孔板（Fisher Scientific，目录号：07-200-589）
聚苯乙烯一次性移液管，10 ml，无菌（Fisher Scientific，目录号：NC9868325）
玻璃移液管，1 ml，无菌（Fisher Scientific，目录号：12-724）
移液吸头，无菌，200μl和1 ml（Fisher Scientific，目录号：02-707-502,02-707-509）
0.45-μm尼龙过滤器（赛默飞世尔科技，目录号：151-4045）
无菌酒精预备垫（Dynarex，目录号：1114）
无胸腺裸鼠（Foxn1 nu / Foxn1 + ，4-5周，雌性来自ENVOGO，目录号：069（nu）/ 070（nu / +））
人卵巢癌OVCAR-3（ATCC，目录号：ATCC ® HTB-161 TM ）（Khiste et al。，2017）
携带OVCAR-3肿瘤异种移植物和对照的小鼠
1. 接种OVCAR-3细胞（购自ATCC; ~3-5代，每只小鼠1×10 6 /20μl），在无血清培养基中皮下接种到无胸腺裸鼠的左侧腹部（Foxn1nu） / Foxn1 +，4-5周，女性;哈伦）。
2. 在对照组中，我们仅接种20μl无血清培养基。一旦肿瘤直径达到约0.6 cm（~24天），我们将在这些小鼠中腹膜内注射NBD Cer-RUB纳米胶束用于神经酰胺糖基化。
RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11875-093），储存于4°C
胎牛血清（FBS），热灭活（Thermo Fisher Scientific，目录号：10082147），储存于-20°C
磷酸盐缓冲盐水（PBS，10x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：70011-044），保持在4°C使用
NBD C 6 - 神经酰胺（ N - [6 - [（7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-基）氨基]己醇] - D - erythro -sphingosine）（Avanti Polar Lipids，目录号：810209），储存于-20°C
NBD C 6 - 葡萄糖神经酰胺，（ N - 己酰基-NBD-葡糖神经酰胺）（Matreya，目录号：1622-001）
Pierce TM BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23227）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：9048-46-8），储存于4°C
NP40细胞裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：FNN0021），储存于-20°C
哺乳动物的ProteaseArrest TM （G-Bioscience，目录号：786-433），储存于4°C
用于HPLC的甲醇，≥99.9％（Sigma-Aldrich，目录号：67-56-1）
用于HPLC的氯仿，≥99.5％（Sigma-Aldrich，目录号：67-66-3）
HPLC用水（Fisher Chemical，目录号：7732-18-5）
用于HPLC的 Ortho - 磷酸（Sigma-Aldrich，目录号：7664-38-2）
无水乙醇（Fisher Chemical，目录号：A405-20）＆nbsp;
Rubusoside（RUB）（西格玛奥德里奇，目录号：62933-10MG）
NBD C 6 -ceramide-rubusoside（NBD Cer-RUB）溶液（见食谱）
NBD Cer-RUB纳米胶束（见食谱）
NP40蛋白质裂解液（见食谱）
用于HPLC分析的溶剂系统（参见食谱）
溶剂A
溶剂B.
NBD C 6 - 神经酰胺或NBD C 6 - 葡萄糖神经酰胺标准溶液（见食谱）
10μNBNDC 6 - 神经酰胺
10μMNDBC 6 - 葡糖神经酰胺

注意：将所有试剂保存或保存在室温下，指示物品除外。

设备

移液器和移液器
高精度显微切割剪刀（Fisher Scientific，目录号：08-953-1B）
分析天平（Mettler Toledo，目录号：ME54TE / 00）
冷藏室，-20°C（Fisher Scientific，目录号：18LC-16WW-FS）
冷冻室，-80°C（Thermo Scientific，目录号：ULT1386-5-D41）
标准细胞培养罩＆nbsp;
涡旋混合器（Fisher Scientific，目录号：02-215-360）
HPLC系统，Agilent 1220 Infinity II LC和Agilent 1260荧光检测器（Agilent Technologies）
HPLC Colum，ZORBAX Rx-SIL 4.6 x 250 mm，5μM（安捷伦科技，目录号：880975-901）
离心机（Eppendorf，型号：5804 R）
离心机（Eppendorf，型号：5424 R）
水浴和孵化器
Reacti-Vap蒸发器（Thermo Fisher Scientific，目录号：TS-18826）
超声波处理器（Fisher Scientific，型号：CPX130PB）
微孔板读板机（BioTek，Synergy HTX多模式读卡器）

软件

用于统计分析的Prism 5v（GraphPad Software Inc.）
用于HPLC分析的Agilent OpenLab CDS（EZChrom版本，A.04.05）

程序

简言之，我们注入了NBD C 6 -Cer-RUB纳米胶束（Zhang et al。，2012; Hosain et al。，2016; Khiste et al。，2017）进入荷瘤小鼠，小鼠的活组织将NBD C 6 - 神经酰胺转化为NBD C 6 - 葡萄糖神经酰胺。注射后3小时，我们收集所有组织，包括肿瘤，然后提取脂质。此外，我们应用HPLC分析NBD葡萄糖神经酰胺并评估组织的体内 GCS活性。

将NBD Cer-RUB注射到小鼠体内和体内糖基化
1. 在无菌条件下（配方1）制备NBD Cer-RUB溶液（NBD C 6 -Cer 0.25 mg / ml）并保持在冰上（图1A）。
2. 平衡每只小鼠的体重并计算NBD C 6 Cer-RUB溶液的注射量，基于每只携带OVCAR-3肿瘤异种移植物的小鼠1 mg / kg体重（材料和试剂）＃20）。例如，我们将含有25μgNBDC 6 - 神经酰胺的100μlNBDC 6 Cer-RUB溶液注射到25g小鼠中。
3. 在动物操作罩中，将NBD Cer-RUB溶液置于U-100胰岛素注射器中，在用70％酒精擦拭注射部位皮肤后腹膜内注射到小鼠（食谱1,5个病例/组）中（图1B）。
4. 将注射的小鼠保持在笼中3小时，允许在活动物中摄取NBD C 6 - 神经酰胺和神经酰胺糖基化。注射间隔约10分钟。
5. 根据注射顺序，对患有颈椎脱位的小鼠进行安乐死，并从每组三只小鼠中解剖组织，包括肝，肺和肿瘤。
6. 用无菌PBS在35-mm培养皿中冲洗组织两次，并用无菌纸巾吸收。
7. 解剖并将每只小鼠的组织放入微量离心管中，保存在冰上或储存在-80°C。
  
  图1.腹腔注射NBD Cer-RUB纳米胶溶液给小鼠。 A. NBD Cer-RUB复合物是纳米胶束。 B. NBD Cer-RUB溶解于RPMI-1640培养基中，腹腔注射到小鼠体内，通过GCS进行体内糖基化。
组织收集和提取脂质和蛋白质
1. 从所有样品的相同组织（肝脏，肺，每组5只小鼠的肿瘤）中解剖并称量50mg碎片中的两个，并分别放入含有50μl无菌PBS的2个微量离心管中。使用一组样品进行脂质提取，另一组进行蛋白质提取。
2. 用微型剪刀剁碎组织并用冰上的PBS中的超声处理器对其进行超声处理。
3. 用于脂质提取：
  1. 加入100μl水并将组织悬浮液转移到4ml透明玻璃小瓶中，用于所有样品。
  2. 在玻璃小瓶中加入0.85ml水，1.0ml甲醇和1.0ml氯仿，并涡旋30秒混合。将样品在室温下保持20分钟，每5分钟后涡旋30秒。＆nbsp;
  3. 将玻璃瓶管在4,500 x g ，室温下离心10分钟，以分离有机相和水相。
  4. 轻轻握住玻璃瓶，用巴斯德吸管将有机相（底层）转移到新的琥珀色4毫升玻璃瓶中（图2，视频1）。
  5. 取5μl有机溶液，加入含有145μl甲醇的荧光96孔板，一式两份。在酶标仪中测量荧光单位（BioTek Synergy HT，λ激发470nm，λ发射530nm）。平均荧光单位将用于标准化所有样品。
  6. 用玻璃移液管将800μl每种样品的有机溶液转移到琥珀色的4ml玻璃小瓶中，并用氮气完全干燥（约20分钟）。紧紧关闭样品瓶，将所有样品保存在-20°C以备后续使用。
    
    图2.提取后转移脂质提取物离心后，有机溶液处于小瓶的下部阶段。将含有提取的荧光脂质的下层相用巴斯德吸管转移到新的琥珀色玻璃小瓶中。这一步需要在实验前练习。
    
    视频1.用巴斯德吸管在下层转移脂质提取物。将左手拇指和食指之间的样品瓶保持在约65°，将移液器吸头插入底层到样品瓶的最低角。用移液器辅助缓慢吸出下层溶液（~900μl），然后将其转移到新的玻璃瓶中。
4. 用于蛋白质提取：
  1. 加入含有ProteaseArrest（配方3）的200μlNP40裂解缓冲液，并与组织悬浮液混合（来自步骤B1和B2），并涡旋30秒。
  2. 将管在冰上孵育40分钟，每5分钟涡旋30秒。
  3. 将样品在9,400 x g ，4℃下离心10分钟。
  4. 在新的微量离心管中收集每个样品的上清液，并储存在-80℃，除了用于进一步蛋白质测量的部分。
  5. 一式三份加入2μl蛋白质提取物，并与100μlBCA试剂（50：1，试剂A：B）混合，进入96孔板。使用牛血清白蛋白（BSA，0,5,10,20,40μg）生成标准曲线。
  6. 在酶标仪中测量吸光度（λ= 562nm; BioTek Synergy HT）并用BSA标准获得样品的蛋白质浓度（ x μg/μl）。每种样品的总蛋白量： Pro = x×160 （μg）（来自50 mg组织）。
高效液相色谱法分析NBD C 6 - 葡萄糖神经酰胺对小鼠组织的影响
1. 在标准溶液中用NBD C 6 - 神经酰胺表征和测量NBD C 6 - 葡糖神经酰胺。
  1. 将Agilent 1220 Infinity LC系统与色谱柱（ZORBAX Rx-SIL5μm，4.6 x 250 mm，正相）和溶剂连接，并用溶剂A平衡，流速为1 ml / min，持续60 min。
  2. 设置OpenLab CDS EZChrom程序：流速1 ml / min，进样体积5μl，线性梯度14 min（溶剂A 100％~0，溶剂B 0~100％）和荧光检测（λ激发470 nm， λ发射530 nm）。＆nbsp;
  3. 分别向LVI小瓶中加入100μlNBDC 6 - 神经酰胺（Cer）和NBD C 6 - 葡萄糖基（GlcCer）溶液。这些溶液含有浓度逐渐增加的Cer和GlcCer（0,0.032,0.063,0.125,0.25,0.5和1μM;见配方5）（图1A）。＆nbsp;
  4. 将LVI样品瓶装入HPLC系统的转盘中，一式三份运行分析并保存文件。
2. 表征样品产生的NBD葡糖神经酰胺。
  1. 在琥珀色玻璃小瓶的肝脏提取物中加入100μl甲醇/氯仿以重建脂质（步骤B4f）。
  2. 将50μl重建的肝脏脂质（~2,000个荧光单位）转移到LVI小瓶中。
  3. 将2μlNBDC 6 - 葡糖神经酰胺（0.125μM）加入LVI小瓶中并与肝脏脂质混合。
  4. 加载HPLC系统的转盘并分析三次。
3. 测量NBD葡萄糖神经酰胺和样品的神经酰胺。
  1. 在琥珀色玻璃小瓶中加入100μl甲醇/氯仿，重构提取的样品脂质。
  2. 将50μl重构样品（~2,000个荧光单位）转移到LVI小瓶中，并加载到HPLC系统的转盘中。
  3. 设置OpenLab CDS EZChrom程序：流速1 ml / min，进样体积5μl，线性梯度14 min（溶剂A 100％-0，溶剂B 0-100％）和荧光检测（λ激发470 nm， λ发射530nm）。
  4. 运行HPLC分析一式三份并保存文件。

数据分析

生成Cer和GlcCer的标准曲线。
1. 在OpenLab CDS EZChrom程序中打开的标准品的色谱图中，确定NBD C 6 - 神经酰胺（Cer）和NBD C 6 - 葡萄糖神经酰胺（GlcCer）的平均保留时间。在该色谱柱和溶剂系统中，Cer在3.10±0.07 min处定位，GlcCer在3.8±0.06 min处定位。
2. 将HPLC数据（rslt。）从CDS EZChrom转移至Prism软件。定义Y轴的AUC值和相应的pmols（每5μl，注射值）NBD C 6 - 葡萄糖神经酰胺（GlcCer）和C 6 - 神经酰胺（Cer）在X轴（图1A）。
3. 使用GlcCer的等式（ Y = MX + C ）生成标准曲线。这里，Y表示AUC（曲线下面积，荧光单位），X脂质量，M斜率和C方程常数。对于GlcCer， Y = 177.42 X＆nbsp; + 5.0143。
4. 比较肝脏的色谱图以确认肝脏样本中的GlcCer（图3B）。
  
  图3.鞘脂的HPLC色谱图。 A.C 6 -Cer和C 6 -GlcCer的定量。将NBD C 6 -Cer和C 6 -GlcCer（1：1）的混合标准物分离并通过HPLC进行荧光检测定量。 C 6 -Cer和C 6 -GlcCer的保留时间分别为3.1和3.8。每个数据点代表三次独立实验的平均值±SD。 B.小鼠肝脏中NBD C 6 -GlcCer的表征。给予NBD C 6 -Cer-RUB（1 mg / kg， ip ; 180 min）后从小鼠肝脏中提取的脂质加入NBD C 6 -GlcCer（每5μl0.25pmol）并分别通过HPLC分析。
定义样品的体内 GCS活性。
1. 在样品的色谱图中表征Cer和GlcCer并用标准曲线和方程计算GlcCer量。 GlcCer量（pmol /100μl提取物）， Pgc = 20×X = 20×（Y-5.0143）/177.42，（图4A）。
2. 确定GCS的体内活动。酶活性（fmol /μg）简称为在1μg组织蛋白中由GCS在3小时内产生的GlcCer（fmol）。组织GCS酶活性可以是 Zgcs = Pgc / Pro （ Pgc 来自数据分析步骤2a，Pro from Step B4f）（图4B）。＆nbsp;
3. 计算示例：
  
  对于肺和肝的情况，GCS在肿瘤中的体内活性显着高于正常组织中的活性（图4B和4C）。
  
  图4. GCS在小鼠体内的器官内Cer糖基化。 A.HPLC色谱图。将NBD Cer-RUB纳米胶束（1mg / kg， i.p。; 4例/组）给予携带OVCAR-3肿瘤异种移植物的小鼠;注射后3小时，快速切除组织用于脂质提取和HPLC分析。通过HPLC分析提取的鞘脂的大致相等荧光单位样品。 B.器官内GCS活动。 ***， P ＆lt;与肺或肝相比0.001。 C.组织GCS的Western印迹。解析提取的等量蛋白质（50μg蛋白质/泳道），然后用GCS或GAPDH抗体进行免疫印迹。 GCS蛋白质水平表示为从四个印迹平均的GCS / GAPDH光密度的比率。 *， P ＆lt; 0.05与肺或肝相比。

笔记

在分析和计算酶活性时，我们将总脂质和总蛋白质提取物的80％分别用于含有脂质的1 ml有机层中的800μl和含有蛋白质的200μl蛋白质裂解缓冲液中的160μl。
处理NBD C 6 - 神经酰胺或葡萄糖神经酰胺以及具有防光性的解剖组织，包括使用琥珀色玻璃小瓶，铝盖和昏暗的灯。
与BSA复合的NBD C 6 - 神经酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：N22651）可用于分析细胞中的GCS活性，如前所述（Gupta et al。，2010; Khiste et al。，2017）。
NBD Cer-RUB（1mg / kg）的顶内注射可以为神经酰胺糖基化提供足够的底物，以测量除小鼠脑外的大多数组织（包括肿瘤异种移植物）的体内 GCS活性。
NBD C 6 -Cer和NBD C 6 -GcLcer的分析也可以在具有来自Waters，Shimadzu或其他供应商的荧光检测器的类似HPLC系统上进行。 NBD C 6 -GlcCer或NBD C 6 -Cer的保留时间和检测灵敏度可能随溶剂，色谱柱和HPLC系统而变化，但仍然相同。

食谱

NBD Cer-RUB溶液，0.25 mg / ml
在无菌4ml玻璃小瓶中加入25.28mg NBD Cer-RUB纳米胶束（含0.5mg NBD C 6 - 神经酰胺）和2ml RPMI-1640培养基（无血清），涡旋30秒，并在动物注射前保持室温
NBD Cer-RUB纳米胶束
NBD C 6 - 神经酰胺（NBD Cer）与rubusoside（RUB）（1：50，w / w）复合以产生NBD Cer-RUB纳米胶束，如前所述（Khiste et al 。，2017）。
一个。将NBD Cer溶解在含有RUB（140 g / 100 ml）的乙醇溶液中湾通过0.45-μm尼龙过滤器过滤此溶液
C。蒸发并冻干以产生粉末形式的NBD C 6 -Cer-RUB复合物
d。将NBD Cer-RUB粉末储存在4°C
NP40蛋白质裂解液
在1.5 ml微量离心管中加入198μlNP40细胞裂解缓冲液和2μlProteaseArrest TM 溶液，混合并在使用前保存在冰上
用于HPLC分析的溶剂系统
溶剂A：
在500毫升玻璃瓶中混合400毫升氯仿，100毫升甲醇和0.5毫升邻 - - 磷酸并紧紧关闭
溶剂B：
在500毫升玻璃瓶中混合300毫升氯仿，170毫升甲醇，30毫升HPLC水和0.5毫升邻 - 磷酸 - 并紧紧关闭
NBD C 6 - 神经酰胺或NBD C 6 - 葡萄糖神经酰胺标准溶液
10μMPNDC 6 -ceramide （储备液，-20°C）：
在4毫升琥珀色玻璃小瓶中加入10微克NBD C 6 - 神经酰胺（mw 575.75）和1.737毫升氯仿/甲醇（5：1，v：v），涡旋并紧紧关闭。 /> 10μMNDBC 6 - 葡萄糖神经酰胺（储备液，-20°C）：
在4毫升琥珀色玻璃小瓶中加入10微克 N - 己酰基-NBD-葡糖神经酰胺（mw 738）和1.355毫升氯仿/甲醇（5：1，v：v），涡旋并紧紧关闭
注意：每种储备溶液用氯仿/甲醇稀释两到三倍，稀释后的溶液用于生成标准曲线。

致谢

这项工作得到了国家癌症研究所（Y.Y.L）的公共卫生服务/ NIH资助R15CA167476和国家普通医学科学院（Y.Y.L）的P20 GM103424-11的支持。这项工作也得到了日本水谷科学基金会（MFRG120068 Y.Y.L）的部分支持。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

伦理

所有动物实验均由路易斯安那大学门罗分校动物护理和使用委员会（ULM）（方案＃16DEC-YYL 01）批准，并严格按照NIH指南定义的良好动物实践进行。

参考

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