材料和试剂

琼脂糖VII型（低熔点）（Sigma-Aldrich，目录号：A9045-100G）
Neurobasal（Life Technologies， Gibco ^®，目录号：21103-049）
B27（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：17504-04）
谷氨酰胺（Life Technologies，< Gibco ，目录号：25030）
青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4458）
马血清（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：16050-122）}
N2（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：17502-048）}
1x PBS
Krazyglue或类似的胶水

设备

Vibratome（Leica，型号：VT1000 S）
Millicell，灭菌培养板插入物（EMD Millipore）
解剖工具（环形钳，锯齿镊子，细剪）
弯曲的小铲
30 mm培养皿

程序

移除电穿孔小鼠胚胎的头部（请参阅" 在子宫内电穿孔小鼠胚胎脑57"（Ge，2011），并将其置于冰冷的1x PBS中。
解剖整个大脑，并将其放入冰冷的PBS。不要让大脑在冰冷的PBS中30分钟。更快地处理大脑;将获得更好的脑切片质量
在30℃培养皿中加入在1×PBS中制备的3％低熔点琼脂糖（使用足够的琼脂糖覆盖脑），在微波中在40℃预热。用温度计监测温度，同时用它控制琼脂糖溶液。当温度降至约35°C-37°C时，大脑将被放入琼脂糖中，每次准备脑切片时，尝试使用新鲜的3％低熔点琼脂糖。
用弯曲的刮刀从冰冷的PBS中取出大脑，用Kimwipe小心地从组织中取出PBS溶液。使用Kimwipe作为灯芯。保持培养中大脑结构的关键步骤：尝试从组织中尽可能多地除去PBS溶液。避免Kimwipe粘附到大脑，以防止组织损伤。放置Kimwipe尽可能接近，你可以到大脑吸收尽可能多的PBS溶液。 "无PBS溶液"的脑更好地嵌入琼脂糖溶液中。因此，一旦脑切片，脑切片不从琼脂糖上分离。
将大脑放入3％低熔点琼脂糖（35°C-37°C）在陪替氏培养皿（嗅球面朝下，图1A）。
把培养皿放在冰上，等待琼脂糖凝固。小心地用刮刀保持大脑的位置，同时琼脂糖凝固。
剪切大脑周围的琼脂糖，保持大脑在琼脂糖块的中间。尝试切割金字塔形状的块，使得大脑（小脑）的基部是金字塔的底部，并且嗅球面对金字塔的顶点（图1B）。这种琼脂糖块配置将允许块在胶合在vibratome托盘的支架（琼脂糖金字塔的基部面向vibratome支架）的稳定位置。
用Krazyglue或类似的胶将含有大脑的琼脂糖块胶接到vibratome托盘上
将冰冷的1x PBS加入vibratome托盘以覆盖琼脂糖块。
切琼脂糖块。切片厚度：240μm（随着时间的推移，薄片更薄的组织）。振动器设置：速度4-5;振动6.
小心收集片用弯曲的小铲，以避免组织从琼脂糖分离。将切片转移到含有1ml培养基（图C;补充有B27，N2,0.5mM谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素和5％马血清的Neurobasal）的Millicell培养插入系统中。放入尽可能多的切片，你可以放在膜插入物的顶部（通常4-5片每个插入）。
用移液管吸头小心地移除切片周围的溶液。组织必须暴露于空气中。
将培养插入皿与切片放入组织培养孵化器（37℃）1-2小时
切片准备使用（即延时成像）。该培养系统已用于48小时时间推移成像（de Anda F.，et al。，2010; Ge et al。，2010）。也可以使用这种培养系统用于药理学治疗（de Anda F.，et al。，2010; Ge等人，2010）。

图1. （A）大脑是嵌入的，嗅球面朝下，在3％低熔点琼脂糖的preti菜。（B）一旦琼脂糖凝固，将大脑周围的琼脂糖切成锥体形状，使得大脑底部（小脑的侧面）位于金字塔的底部，嗅球面向金字塔的顶点。（C）从包含1ml培养基的Millicell培养插入系统顶部的脑转移冠状切片。

食谱

Neurobasal（250ml）

50x B27	4.5 ml
200mM谷氨酰胺	2.5 ml
50x青霉素/链霉素	2.5 ml
马血清	12.5 ml
100x N <2>	2.5ml（应该在实验当天加入培养基;10μl/1ml培养基）
总计	24.5ml/250ml Neurobasal

该介质可以在4℃避光保存几个月。

致谢

该协议改编自以前发表的论文：Calderon de Anda等人（2010）。 C.d.A.F.得到了Simons自闭症倡议和大脑基础设施赠款计划的博士后研究支持。

参考文献

Calderon de Anda F.，Meletis，K.，Ge，X.，Rei，D.and Tsai，L.H。（2010）。中枢运动对于新大脑皮质中初始轴突形成至关重要。 30（31）：10391-10406。
Calderon de Anda F.，Rosario，AL，Durak，O.，Tran，T.，Graff，J.，Meletis，K.，Rei，D.，Soda，T.，Madabhushi，R.，Ginty，DD，Kolodkin ，AL和Tsai，LH（2012）。自闭症谱系障碍易感基因TAOK2 会影响新大脑皮质中的基底树突形成。 Nat Neurosci 15（7）：1022-1031。
Ge，X。（2012）。在子宫内小鼠胚胎脑的电穿孔生物协议 2（13）：e231。
Ge，X.，Frank，C.L.，Calderon de Anda，F.and Tsai，L.H。（2010）。 Hook3与PCM1相互作用以调节近中心材料装配和神经发生的时机。 Neuron 65（2）：191-203。