材料和试剂

移液器吸头（sarstedt，目录号：70762010 [1,000μl]; 70762012 [100μl]和701116 [10μl]）
细胞培养皿100毫米（sarstedt，目录号：83.3902）
猎鹰管15毫升（Sarstedt，目录号：62.544.502）
微管1.5毫升（Sarstedt，目录号：72.690.001）
细胞刮刀（Sarstedt，目录号：83.1830）
J774A.1细胞（ATCC＃TIB-67）
Yersinia enterocolitica 菌株deltaYopM（ Yersinia enterocolitica 血清型O：8菌株WA-314，其中YopM基因被卡那霉素抗性盒Trulzsch 等取代，2004）
Yersinia enterocolitica 菌株deltaYopM（pYopM-CBP-SBP）（deltaPopM菌株与pACYC184中的DNA构建体YopM-CBP-SBP互补; Hentschke et al。，2010）
RPMI1640（Gibco，目录号：61870-010）
胎牛血清（FCS，Gibco，目录号：26140-079）＆nbsp;
青霉素 - 链霉素（Gibco，目录号：15140122）
L-谷氨酰胺（Gibco，目录号：A2916801）
pACYC184载体（NEB; Hentschke et al。，2010）
InterPlay Mammalian TAP系统（安捷伦，产品目录号：240103）
Bromphenol Blue（Serva，目录号：15375.02）
考马斯亮蓝（默克，目录号：1154440025）
Calmodulin Sepharose 4B（GE Healthcare，Life，目录号：17052901）＆nbsp;
Streptavidin Sepharose High Performance（GE Healthcare，Life，目录号：17511301）
完整的蛋白酶抑制剂（罗氏诊断）
甲醇（罗斯，目录号：8388.1）
胰蛋白酶，测序等级修改（Promega，目录号：V5111）
a-SBP抗体（Millipore，clone 20，目录号：MAB10764）
Luria-Bertani肉汤（罗斯，目录号：X986.2）
乙酸（罗斯，目录号：T179）
SDS（罗斯，目录号：CN30.3）
分子量标记（分子量范围10-180 kDa; PageRuler Prestained Protein Ladder，Thermo Scientific，目录号26616）
甘油（Calbiochem，目录号：356350）
β-Mercaptoethanol（Sigma，目录号：M3148-25ml）
Tris（Sigma，目录号：T1503-1KG）
EDTA（罗斯，目录号：80432）
二硫苏糖醇（DTT; Roth，目录号：6908.2 259）
碘乙酰胺（Sigma，目录号：I6125-25g）
NH 4 HCO 3 （Sigma，目录号：09830）
乙腈（Thermo，目录号：51101）
甲酸（Fluka，目录号：94318）
三氟乙酸（TFA; Roth，目录号：CN30.3）
考马斯亮蓝R-250（Serva，目录号：17524.01）
Bromphenol blue（默克，目录号：8122）
NaCl（Roth，目录号：9265.1）
KCl（默克，目录号：1049361000）＆nbsp;
考马斯染色液（见食谱）
考马斯脱色解决方案（见食谱）
SDS-PAGE样品缓冲液（2x）（见食谱）
PBS（10x）（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf，Eppendorf Research Plus，目录号：3123000900）
电源（Bio-Rad，Bio-Rad power PC 200）＆nbsp;
SDS-PAGE电泳细胞（Bio-Rad Mini-Protean II）＆nbsp;
细胞计数室（Hartenstein，Neubauer细胞计数室）
哺乳动物细胞培养箱（Binder，CB系列）
摇动培养箱（Sartorius，型号Certomat BS-1）
旋转混合器（Hartenstein，目录号LD26 / L263）
离心机（Eppendorf，型号：5417R）＆nbsp;
真空干燥机（Speed Vac SC110，Savant）
MALDI-TOF质谱仪（Bruker Daltonics，REFLEX IV）

程序

克隆CBP-SBP标记的细菌效应蛋白用于细菌表达
含有钙调蛋白结合肽的串联亲和标签（CBP; Stofko-Hahn 等，1992）和链霉抗生物素蛋白结合肽（SBP; Keefe 等。，2001）可以从可从Interplay TM 串联亲和纯化系统（Agilent）商购获得的pCTAP载体衍生。克隆使用标准分子生物学技术进行。我们在pACYC184中产生YopM-CBP-SBP的克隆策略在原始出版物（Hentschke 等人，，2010）中有详细描述。简而言之，克隆可以如下进行：
1. 通过PCR扩增去除感兴趣的细菌效应物的终止密码子以插入C-末端CBP-SBP-标签。得到的PCR产物应含有感兴趣的效应蛋白的推定的内源启动子区，以确保生理表达水平。
2. 用合适的限制酶消化PCR产物和pCTAP。
3. 将效应蛋白连接到pCTAP中。
4. 用合适的酶消化所得的pCTAP效应蛋白构建体，以在下一步中将其连接到质粒中。
5. 将步骤A4的pCTAP效应蛋白构建体连接到低拷贝载体中。在我们的案例中，我们使用了pACYC184（Hentschke et al。，2010）。
  注意：使用低拷贝质粒确保细菌效应蛋白的生理表达水平。
6. 这导致携带细菌效应蛋白的载体C末端标记有来自pCTAP载体的两个连续亲和标记CBP和SBP（图1）。
  注意：可以使用试剂盒中提供的pNTAP载体将TAP标签克隆到N末端。
  
  图1.方案中描述的克隆程序的示意图。（1）通过PCR扩增去除感兴趣的细菌效应物的终止密码子。用合适的限制酶（A和B）消化PCR产物和pCTAP。（3）将效应蛋白连接到pCTAP中。（4）在（研究的）细菌中表达感兴趣的CBP-SBP标记的效应蛋白，消化pCTAP构建体“效应子-CBP-SBP”（左）和您选择的低拷贝克隆质粒（适用于所研究的生物体））用适当的限制酶（C和D）。（5）将步骤4的构建体“效应子-CBP-SBP”连接到低拷贝克隆质粒中。
含有CBP-SBP标记的效应蛋白的细菌菌株的构建
1. 从您想要研究的细菌菌株中去除内源性效应蛋白。在我们的例子中， Yersinia 毒力质粒pYV上的YopM蛋白已经被卡那霉素抗性盒取代（原始出版物中有更详细的描述; Trulzsch et al。， 2004）导致YopM缺失菌株deltaYopM。
2. 效应子缺失菌株可以用含有TAP标记的效应蛋白的质粒补充。在我们的病例中，缺乏YopM的 Yersinia enterocolitica 血清型0：8菌株WA-314（Heesemann和Laufs，1983）补充了表达YopM-SBP-CBP的pACYC184载体，产生了一种名为WA-314ΔYopM（pYopM-CBP-SBP）（Hentschke et al。，2010）。
靶细胞感染
用含有CBP-SBP标记的效应蛋白的菌株感染细胞适当的时间段。
1. 准备10个100毫米的细胞培养皿（总共10个 8 细胞）。＆nbsp;
2. 在37℃和5％CO 2 的RPMI1640中培养J774A.1细胞过夜，所述RPMI1640补充有10％FCS，100IU / ml青霉素和100μg/ ml链霉素和另外的2mmol谷氨酰胺。＆nbsp;
3. 在实验前一天制备过夜细菌预培养物。简而言之，从平板上划出菌落并将菌落悬浮在2ml含有适当抗生素的Luria-Bertani肉汤（LB）中。在27°C下摇动 Yersinia 菌株过夜。＆nbsp;
4. 在新鲜LB中稀释过夜培养物1:20（总共40ml）。在37°C下再培养 Yersinia 2小时，以诱导 Yersinia III型分泌机制的活化和Yops的表达。＆nbsp;
5. 离心细菌培养物（4℃，5,000 x g ，10分钟）并重悬于冰冷的PBS中。
6. 将细菌悬浮液调节至OD 600 = 0.36。
7. 感染后，取出J774A.1细胞培养基，换成无抗生素RPMI1640。＆nbsp;
8. 通过每100mm培养皿加入1ml在先前步骤E6中制备的经调节的细菌悬浮液来感染真核细胞。每100毫升培养皿1毫升等于约50：1的感染复数（每个细胞50个细菌，Hentschke 等人，，2010）。
9. 在感染期间培养37°C和5％CO 2 的细胞。
  注意：J774A.1细胞用 Yersinia 感染90分钟。感染时间可能因细胞类型不同而不同。
准备蛋白质提取物
所有蛋白质纯化步骤应在4°C下进行，以防止相互作用的蛋白质解离。所有量均指示裂解物体积为10ml。
1. 用补充有1x完全蛋白酶抑制剂（Roche）的冰冷PBS感染三次后洗涤细胞。
2. 通过细胞刮刀（Sarstedt）在10ml裂解缓冲液（每个板1ml）中用细胞刮板（1ml /板）刮下细胞，用Interplay TM 串联亲和纯化试剂盒（Agilent）补充1x完全蛋白酶抑制剂（罗氏）并将它们转移到15毫升Falcon管中。在一个15毫升Falcon管中混合所有10个培养皿的裂解物。
3. 通过在-80℃冰箱中连续三次冻融循环细胞20分钟并在冷水中孵育10分钟来裂解细胞。
4. 通过在4℃下以16,000 x g 离心10分钟来清除细胞。
5. 将上清液收集在新的15ml Falcon管中。
6. 在-20°C下储存5μl裂解液的等分试样，通过Western印迹进一步分析。
7. 每ml裂解液中添加4μl0.5M EDTA和0.7μl14.4Mβ-巯基乙醇，在Interplay TM 串联亲和纯化试剂盒（安捷伦）中提供。
使用链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠纯化蛋白质复合物
1. 通过将7μl14.4Mβ-巯基乙醇（试剂盒中提供）和1x完全蛋白酶抑制剂（Roche）加入10ml SBB中来制备链霉抗生物素蛋白结合缓冲液（SBB）。通过倒置管混合缓冲液并将其保持在冰上。制备的缓冲液可以在4℃下储存长达两周。
2. 洗涤链霉抗生物素蛋白树脂浆液：在1,500℃下在500℃下将500μl所提供的链霉抗生物素蛋白琼脂糖凝胶在4℃下离心10分钟。（500微升提供的琼脂糖凝胶具有250μl树脂加250μl乙醇储存缓冲液，产生500μl50％浆液。）
3. 用移液管除去上清液。
4. 弃去上清液，除去乙醇储存缓冲液。
5. 将树脂重悬于1 ml SBB中。
6. 如步骤E2-E5所述，通过离心和再悬浮，用1ml SBB缓冲液洗涤树脂各两次。每个洗涤步骤使用一个新的1.5毫升管。
7. 将树脂在250μlSBB中收集在新的1.5ml管中，得到500μl50％浆液。
8. 向裂解液中加入500μl经洗涤的链霉抗生物素蛋白50％浆液（图2-1）。
9. 在旋转混合器（Hartenstein）上以10rpm恒定旋转，在4℃下孵育2小时。
10. 通过在1,500×g g离心5分钟收集琼脂糖凝胶，并取出并将上清液储存在-20℃的1.5ml管中进行进一步的Western印迹分析。
11. 用1 ml SBB清洗琼脂糖凝胶两次（图2-2）。
12. 每个洗涤步骤使用一个新的1.5毫升管。
13. 通过在1,500 x g 离心5分钟收集洗过的琼脂糖凝胶并弃去上清液。＆nbsp;
14. 将链霉抗生物素蛋白洗脱缓冲液（SEB）与7μl14.4Mβ-巯基乙醇（试剂盒中提供）和1x完全蛋白酶抑制剂（Roche）一起加入10ml SEB中。 SEB缓冲液必须保持在4°C且应避光。
15. 向琼脂糖珠中加入500μl链霉抗生物素蛋白洗脱缓冲液（SEB）。
16. 对于蛋白质复合物的洗脱，在4℃旋转孵育30分钟。
17. 通过在1,500 x g /℃下在4℃下离心5分钟收集琼脂糖凝胶。
18. 将上清液转移到新的1.5ml管中。
19. 储存10μl上清液用于后续的Western印迹分析。
20. 通过将7μl14.4Mβ-巯基乙醇（在InterPlay Mammalian TAP System试剂盒中提供）和1x完全蛋白酶抑制剂（Roche）加入10ml CBB中来制备钙调蛋白结合缓冲液（CBB）。通过倒置管混合缓冲液。将准备好的CBB保持在冰上。
21. 向上清液中加入10μl链霉抗生物素蛋白上清液，然后加入4ml CBB。
使用钙调蛋白琼脂糖珠的第二纯化步骤
1. 如步骤E2-E6所述，用补充有β-巯基乙醇（InterPlay Mammalian TAP System试剂盒）和1x完全蛋白酶抑制剂（Roche）的CBB洗涤钙调蛋白琼脂糖（图2-3）。＆nbsp;
2. 将洗涤过的钙调蛋白琼脂糖凝胶加入洗脱液中（来自步骤E17）。
3. 在4°C下恒定旋转孵育过夜。
4. 用CBB洗涤钙调蛋白琼脂糖凝胶两次。
5. 储存上清液用于进一步的Western印迹分析。
6. 将洗过的珠子在60-100μl2xSDS上样缓冲液中煮沸10分钟（图2-3）。
  
  图2.串联亲和纯化AP系统的示意图。该图是从InterPlay Mammalian TAP System协议修改的（ https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/240101.pdf 。（1）将链霉抗生物素蛋白琼脂糖凝胶添加到细胞中含有SBP-CBP标记的效应蛋白与相互作用配偶体的感染细胞裂解液。（2）用链霉抗生物素蛋白结合缓冲液洗涤污染物并加入钙调蛋白琼脂糖凝胶。（3）用钙调蛋白结合缓冲液洗涤污染物，用潜在的相互作用配偶体洗脱效应蛋白在2x SDS上样缓冲液中煮沸钙调蛋白琼脂糖珠。
鉴定蛋白质复合物
可以对洗脱液进行SDS-PAGE，然后进行考马斯染色，以确定纯化效率，并对可见条带进行质谱分析。
1. 在10％SDS-PAGE上加载裂解物对照，链霉抗生物素蛋白琼脂糖上清液（Eluate-SBP）和煮沸的钙调蛋白琼脂糖上清液（Eluate-CBP）（图3）。
2. 通过SDS-PAGE分离洗脱的蛋白质与步骤F6（50μl）。
3. 将SDS凝胶在10ml Coomassie染色溶液中染色1小时。
4. 将SDS凝胶置于10ml考马斯脱色溶液中2小时或过夜。
5. 用手术刀切出可见的带子。凝胶块的尺寸应尽可能小。
  
  图3.鉴定细菌效应蛋白的相互作用蛋白。 A.代表性的Western印迹分析，以确定串联亲和纯化的每个步骤的纯化效率。用针对SBP的抗体（Millipore clone 20＃MAB10764）检测标记的效应子的存在。在这种情况下，用WA-314ΔYopM（pYopM-CBP-SBP）感染的J774细胞的细胞裂解物进行串联亲和纯化。 B.代表性的考马斯染色的SDS-PAGE，包括串联亲和纯化的纯化步骤。需要切除煮沸的CBP珠的可见条带（编号1至5），以便通过质谱进一步分析。
通过质谱分析可见光带
质谱法用标准程序技术进行。在Hentschke 等人（2010）中可以找到 Yersinia 效应蛋白YopM的相互作用蛋白的鉴定细节。
1. 将凝胶带切成小块。
2. 用新制备的10mM DTT在100mM碳酸氢铵储备溶液中于56℃溶解30分钟，减少蛋白质。添加足够的DTT溶液以完全覆盖凝胶块。
3. 用环境温度下在100mM碳酸氢铵储备溶液中溶解的55mM碘乙酰胺在黑暗中修饰半胱氨酸残基20分钟。凝胶块应完全覆盖。
4. 用胰蛋白酶消化洗脱液中的蛋白质（5ng胰蛋白酶/μl，在50mM NH 4 HCO 3 ，37℃，16h）。
5. 通过加入含有50％乙腈（ACN）/ 5％甲酸（v / v）的水溶液提取溶液，从凝胶块中提取肽。提取溶液的体积应该是凝胶块体积的两倍。在37°C的混合器上孵育30分钟。＆nbsp;
6. 收集上清液。＆nbsp;
7. 加入100％ACN并在37℃的混合器上孵育15分钟。＆nbsp;
8. 收集上清液，并将其与上一步骤H6中收集的上清液合并。＆nbsp;
9. 加入足够的H 2 O以覆盖凝胶块，并在37℃的混合器上再次孵育15分钟。
10. 将上清液与先前步骤H8的上清液合并。
11. 将提取溶液以2：1的比例添加到凝胶块中，并在37℃的混合器上孵育30分钟。将上清液与收集的其他物质结合。
12. 提取溶液的体积应该是凝胶块体积的两倍。
13. 在环境温度下使用中到高的干燥速率在真空浓缩器中干燥提取物。根据您的音量，该步骤可能需要几个小时。
14. 将提取物溶于适当体积的5％甲醇/ 5％甲酸中。
  注意：解决方案应完全涵盖提取物。
15. 将0.5μl样品与等体积的基质溶液（氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）在65％水/ 35％乙腈/0.1%三氟乙酸（TFA）中的饱和溶液）混合。
16. 通过干滴法将混合物施加到MALDI靶上。＆nbsp;
17. 在反射器模式下在MALDI-TOF质谱仪（Bruker Daltonics）上确定肽质量指纹数据。设置取决于您可用的质谱仪。

数据分析

获得的MALDI-TOF分析的肽质量指纹的数据分析可以使用Mascot搜索算法2.2版（Matrix Sciences，London，UK）进行。

使用以下参数：质量耐受：50ppm，允许一次错过的胰蛋白酶切割，固定修饰：氨基甲酰基甲基半胱氨酸，可变修饰：单氧化的甲硫氨酸。
限制搜索受感染细胞的生物体，例如， mus musculus 。
结果，期望值可以与特定蛋白质序列匹配，以鉴定效应蛋白质的相互作用配偶体。

笔记

如果没有针对效应蛋白的抗体，请使用市售的抗SBP标签抗体（例如，Millipore，克隆20，目录号：MAB10764）。
如果使用考马斯染色法未能获得可见条带，则增加细胞数并尝试SDS-PAGE的银染色。
如果您遇到非特异性相互作用或污染的问题，添加阴性对照（即，没有效应子的pCTAP质粒）来感染靶细胞，将有助于识别污染物的非特异性结合。
我们应用电穿孔转化在小肠结肠炎耶尔森氏菌缺失菌株中含有TAP标记的效应蛋白的质粒。重要的是细菌处于指数生长阶段并仔细清洗以确保它们不含盐。（Conchas和Carniel，1990）

食谱

考马斯染色液
0.1％（w / v）考马斯亮蓝R-250（Serva）
25％（w / v）甲醇（罗斯）
10％（w / v）乙酸（默克）
双蒸<子> 2 0
考马斯脱色解决方案
25％（w / v）甲醇（罗斯）
10％（w / v）乙酸（默克）
ddH 2 O
SDS-PAGE样品缓冲液（2x）
0.5 M Tris（Sigma）
125 mM SDS（Roth）
10％（w / v）甘油（Calbiochem）
2％β-巯基乙醇（Sigma）
0.1％溴酚蓝（默克）
ddH 2 O调节至pH 6.8
PBS（10x）
137 mM NaCl（Roth）
2.7 mM KCl（Roth）

致谢

该协议是原始论文中描述的扩展版本（Hentschke et al。，2010; Berneking et al。，2016）。有关 Yersinia 效应蛋白YopM的相互作用蛋白的克隆程序和鉴定的详细信息可以在原始论文中找到。
＆NBSP;我们感谢UKE Core Facility Mass Spectrometry和Fritz Buck对实验设置和数据分析的帮助。
＆NBSP;这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG（HE 5875 / 1-1）对MH和MS的资助。 LB得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（GRK-1459）的支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

Berneking，L.，Schnapp，M.，Rumm，A.，Trasak，C.，Ruckdeschel，K.，Alawi，M.，Grundhoff，A.，Kikhney，AG，Koch-Nolte，F.，Buck，F。，Perbandt，M.，Betzel，C.，Svergun，DI，Hentschke，M。和Aepfelbacher，M。（2016）。免疫抑制 Yersinia 效应子YopM结合DEAD盒解旋酶DDX3控制核糖体S6激酶在宿主细胞的细胞核中。 PLoS Pathog 12（6）：e1005660。
Heesemann，J。和Laufs，R。（1983）。构建可动员的 Yersinia enterocolitica 毒力质粒。 J Bacteriol 155（2）：761-767。
Hentschke，M.，Berneking，L.，Belmar Campos，C.，Buck，F.，Ruckdeschel，K。和Aepfelbacher，M。（2010）。 Yersinia 毒力因子YopM通过干扰去磷酸化诱导持续的RSK活化。< / a> PLoS One 5（10）：e13165。
Keefe，A。D.，Wilson，D。S.，Seelig，B。和Szostak，J。W.（2001）。使用纳摩尔亲和链霉亲和素结合肽一步纯化重组蛋白，SBP-Tag 。 Protein Expr Purif 23（3）：440-446。
Stofko-Hahn，R.E.，Carr，D.W。和Scott，J.D。（1992）。重组蛋白的单步纯化。表征与II型cAMP依赖性蛋白激酶结合的微管相关蛋白（MAP 2）片段。 FEBS Lett 302（3）：274-278。
Trulzsch，K.，Sporleder，T.，Igwe，E。I.，Russmann，H。和Heesemann，J。（2004）。 Yersinia enterocolitica O：8的主要分泌物对致病性的贡献在小鼠感染模型中。感染免疫 72（9）：5227-5234。
Conchas，R.F。和Carniel，E。（1990）。用于转化 Yersinia 的高效电穿孔系统。 Gene 87（1）：133-137。