材料和试剂

Kimwipe纤维素擦拭巾（Kimberly Clark，目录号：34256）
Sylgard 184（道康宁，目录号：4019862）
磁条（McMaster Carr，目录号：5699K68）
玻璃板（McMaster Carr，目录号：8476k23）
聚乙烯双面医用胶（3M，目录号：1552）
旋转浓缩器（Ultra 10K）（Amicon，目录号：UFC901024）
50毫升锥形管（康宁，目录号：352070）
6孔板（Corning Costar，目录号：3516）
分化良好的人气道上皮细胞培养物（Fulcher et al。，2005）＆nbsp;
气道粘液样本（Button et al。，2012）
己烷（Sigma-Aldrich，目录号：293253）
1x含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：14190144）
100％异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A416-1）
30毫米Millicell培养插入物，亲水性PTFE（Millipore，目录号：PICM03050）
气液界面（ALI）细胞培养基（Randell 等人，，2011）（或可从Stemcell Technologies商购，目录号：05001）

设备

定制设计的3轴剥离测试仪（见下文）
1. 铝挤压件（80/20合并，目录号：1515-LS）
2. 直线轴承（80/20 Incorporated，目录号：6415）＆nbsp;
3. 精密丝杠（McMaster-Carr，目录号：6350K689）
4. 直流伺服电机（Rhino，目录号：RMCS-22）
5. 磁位置传感器（AMS，目录号：AS5311）
6. 运行Labdu接口的微控制器Arduino（Arduino，UNO）
7. 力传感器（Transducer Technologies，GSO系列）（型号取决于所需的灵敏度）
8. 亚克力盒（McMaster-Carr，目录号：8774K12）
稳定微系统TA.XT2i质构分析仪（代替定制剥离测试仪）
CO 2 激光切割机（全光谱激光/ Epilog /等）（可选，见下文）
紫外线消毒器（Thermo）
超声波加湿器（Holmes，目录号：HM500TG1）
湿度传感器和控制器（图片，目录号：WH8040）
容积式移液器（Gilson）
具有2.0微米头的Accusprayer（3M，目录号：166609）
高湿度组织培养培养箱（Nuaire，目录号：NU-4850）

软件

National Instruments Labview电机控制和数据采集软件（可根据要求提供）
Microsoft Excel（或等效）

程序

材料准备
1. 人气道原代细胞培养物
  本文描述的方案利用具有内源性积聚的粘液的高分化人支气管上皮（HBE）培养物。使用先前公布的技术（Fulcher 等人，<2005，以及ALI细胞培养基）将分离的原发性大气道细胞在30mm Millicell膜（24mm内膜直径）上铺板250,000个细胞/平方厘米。 Randell et al。，2011）。将培养物保持在标准组织培养箱（37℃，5％CO 2 ，> 95％湿度）中，持续分化成粘液分泌和纤毛细胞（约4周）和媒体每周更换三次。因为培养物中的气道表面没有清除粘液，所以可以通过改变培养物洗涤间隔来控制气道表面粘液浓度。具有内源性粘液的完整细胞用于所有粘液粘附测量。
2. 粘液收获
  使用先前描述的方法（Button et al。，2018）从分化良好的HBE培养物中收获用于内聚剥离实验的粘液。＆nbsp;
  1. 简而言之，在30-mm支持物上大量（24-96个）HBE培养物留下积累粘液长达4周。在内聚测量的当天，通过将顶端表面与少量PBS（50μl/ cm 2， 2 ）在37℃下孵育30分钟来灌洗粘液。＆nbsp;
  2. 然后使用正位移移液器（Gilson）小心地从培养物中去除粘液样品并合并。将稀释的粘液样品（Ultra 10K; Amicon）在4,000 x g （4℃）下自旋浓缩至所需的粘液浓度。如前所述确定每个步骤的粘液浓度（Button et al。，2012）。在这些研究中，粘液样本在准备的同一天使用，从未冷冻过。
    注意：实际测量不需要事先了解浓度。然而，生物聚合物的内聚/粘合强度预计会对整体浓度敏感，用户的下游分析可能需要此信息。
3. 硅弹性体制剂
  1. 通过温和搅拌将一定体积的Sylgard 184（~100ml / m 2 表面喷涂）部分A和B混合，以使标准1:10比例的气泡形成最小化并使其固化至少30分钟，最长1小时。＆nbsp;
  2. 在初始固化期后，将硅胶以约1：1的比例与己烷在50ml锥形管中混合。＆nbsp;
  3. 在喷涂前将样品搅拌1分钟，彻底混合样品。
设备准备
1. 附着力/内聚剥离试验装置（定制设备）
  如图1B所示，我们研究中使用的定制剥皮机是使用现成的铝挤压件和与精密丝杠连接的直线轴承（80/20 Incorporated）制造的。笛卡尔XY + Z机器人配置是与膝式磨机类似的配置，使得Z轴直接耦合到基座，而X轴在耦合到基座的Y轴上行进。在XY轴的顶部安装一个带有足够通道门的盒子。通过X，Y和Z轴导螺杆的扭矩由DC伺服电机提供。每个电机的步进和方向控制通过微控制器（运行Labdu Interface for Arduino（LIFA）嵌入式代码包的Arduino UNO）和定制的Labview接口代码进行管理。
  ＆NBSP;为了检测在剥离尖端施加的力，我们使用了之前描述的定制设计的力传感器（Holden et al。，2012）。该传感器的核心是铝制薄梁四连杆（180微米厚），连接到IR-LED双光束光学灭弧室。该传感器能够可靠地测量0.1至100 mN的力。
  注意：虽然这些研究中使用的传感器具有良好的粘液粘附/内聚研究动态范围（超过4个数量级），但是等效的商用现成传感器，如Transducer Technologies GSO系列传感器，可以用于测量10至1,000克力（，9.8 mN至9.8 N）范围内的力，具体取决于所测试的材料。 < br /> ＆NBSP;为了测量剥离过程中的亚微米电机位置和剥离速度，非接触式磁性位置传感器（AS5311; AMS）通过相应的极对磁带（305 mm长）固定在每个轴承座上。来自AS5311的信号被发送到Labview软件，该软件生成力与距离的Excel文件。
  ＆NBSP;为了防止可能显着影响粘附力和内聚力测量的粘液脱水，保持样品室中的湿度> 1。 80％由市售的超声波加湿器通过PID和湿度传感器控制。加湿器仅使用蒸馏去离子水，并且加湿器的输出漏斗进入到样品室侧面的12.7mm内径管中。在室内，将湿度管放入50毫升管的顶部，以捕获任何可能的冷凝，但允许湿气逸出。＆nbsp;
2. 粘附/内聚剥离测试装置（市售替代装置）
  用于我们先前研究的系统采用上述定制的剥离测试装置。然而，有许多商业上可获得的装置可能能够容易地适应基于网格的粘液粘附和内聚研究。例如，Stable Micro Systems TA.XT2i质构分析仪以前曾用于测量生物聚合物的粘附性（Repka et al。，2005）。在这里，成功测量的关键是识别能够1）实现剥离和静态网格的设备，2）拥有适当的力传感器（即，称重传感器），对这些测量具有灵敏度（通常<100 mN），和3）调节样品湿度的能力。＆nbsp;
3. 强制传感器校准和剥皮机验证
  在粘附/内聚研究之前，使用以下一种或多种补充方法校准力传感器。
  1. 可以在传感器尖端上放置一系列涵盖分析范围（1到100 mM）的已知重量并确定力。＆nbsp;
  2. 激光切割校准胶带（2125系列; 3M）可以从干净的钢板上剥离，符合ASTM-D3330标准协议，用于剥离测试仪的验证（参考文献6）。＆nbsp;
  3. 最后，作为系统的整体验证，将水饱和的网状物从静态网状物上剥离（例如下面的内聚力研究中使用的那些）。在这里，这样做所需的力是水的表面张力的两倍（即，1.4 mN / cm），因为它产生了两个水覆盖的表面（Button et al。，2018）。＆nbsp;
  注意：洗涤剂/表面活性剂的存在会改变水的表面张力，并相应地进行测量。
粘附/内聚“剥离”网状结构
1. 如背景技术部分所述，用低弹性模量粘液进行粘合和内聚测量的关键是使用与粘液紧密结合并连接到力传感器的“网状物”。在这些研究中，粘合剂粘合剥离网由纤维素网（Kimberly Clark）制备。该网格激光切割成特定尺寸（见下文）。＆nbsp;
2. 为了加强连接到力传感器的纤维素网的脆弱端并防止水从网的“样品”端吸走，在激光切割之前用硅氧烷弹性体涂覆网的一端，如图2所示。
  
  图2.激光切割前的有机硅喷涂网格
3. 在这里，将Kimwipe悬挂在两个平行的50毫米宽的磁性钢板（约3毫米厚）上，这些钢板本身安装在大约200毫米的距离（待涂有硅氧烷弹性体的区域的距离）。
4. 使用喷枪在通风良好的区域或通风橱中将硅氧烷弹性体喷涂在暴露的Kimwipe网上。在这里，除了被磁条覆盖的地方外，Kimwipe到处都渗透着硅胶。＆nbsp;
5. 从磁力夹具中轻轻取出每个Kimwipe，然后悬挂晾干。在喷涂过程中产生的硅树脂渗透区域和无硅树脂区域之间的分界线应清晰可见（见图2）。干燥后，硅层厚度应在10-20微米之间。＆nbsp;
6. 在室温下再固化24-48小时后，每个Kimwipe用蒸馏水预先润湿以除去折痕并平放在铝板上并激光切割成所需尺寸。在我们的研究中，我们生产的剥离网具有5毫米×20毫米的无硅面积和硅胶浸渍网的“尾部”，长约3毫米×30毫米（图3）
  注意：由于粘液与硅浸渍的网状物结合不良，因此确保与粘液接触的部分至关重要（即，非尾部）不含有机硅涂料。
  
  图3.激光切割剥离网。注意“尾部”上涂有硅的区域（较长的薄部分）。
7. 将激光切割网放在两块玻璃板之间，辅以100％异丙醇，使它们平放。将这些网状物放入玻璃板中，然后进行紫外线灭菌，并在此过程中干燥过夜。
  注意：在没有激光切割机的情况下，可以使用手术刀或剃刀刀片将网状条切割成所需的尺寸。然而，关键是要产生具有精确宽度的网格，因为粘合力/内聚力被标准化为宽度（参见下面的数据分析）。
内聚静力网的构造
1. 通过测量撕开粘液所需的力来确定粘液的内聚力。在此，必须具有固定的粘液层，其在剥离过程中不会简单地分离。为此，在两个粘液结合网状物之间（一个剥离网状物，如上所述，一个用3M胶带固定在测量室底部，见图1A），将粘液层切开。＆nbsp;
2. 静态底部网格使用Kimwipe板材制成，一面带有双面医用级胶带（3M＃1552）
3. 然后将网/胶带组合物激光切割成所需的尺寸。在这里，我们将底部网格切割成略大于剥离网格（此处为7 mm×14 mm），以确保剥离网格始终覆盖有粘液。
4. 在研究期间，使用网的双面胶带侧将这些网状物粘附到剥离测试仪的样品室的底部。
粘液粘附测定
1. 具有累积或外源粘液的气道培养物将用于测量粘液粘附。为确保无菌，此程序最好在无菌组织培养罩中进行。＆nbsp;
2. 为了确保适当的网状物/粘液结合，网状物的无硅氧烷区域缓慢降低到气道培养物的顶端表面上。这是最容易从自由端开始并减慢网格其余部分的速度降低，直到整个网格与细胞接触为止。
  注意：由于网孔/尾部与Millipore支撑壁的相互作用（即，塑料壁）会影响剥离过程中的力值，因此务必确保网格放置在文化的中心（见图4）。
3. 定位后，小心地将“尾巴”覆盖在培养物的侧面，以确保该区域不与细胞接触。＆nbsp;
4. 为了确保有效的粘液网结合，应将培养物返回组织培养箱，进行至少30分钟的分析。如果孵育时间较短，那么粘性网状结合不良可能会导致剥离过程中数据显着变化。
  注意：如果所有组件都是无菌的，那么网状物可以无限期地与培养物保持接触。＆nbsp;
5. 在测定之前，将带有培养物的平板放入室中并保持在适当位置（使用胶带或磁铁）。鉴于覆盖气道表面的粘液体积非常小（约几微升）并且粘附力（和内聚力）与粘液浓度成比例，重要的是将湿度维持在>≥1的值。 80％的群组。
6. 将网状物“尾部”定位在力传感器下面，手动或使用电动载物台。在此步骤中，与细胞培养物接触的网状物不移动是至关重要的，因为这可能导致研究失败（因为粘液已经被剥离）。
7. 将嵌入式网状物的有机硅渗透“尾部”端连接到导线末端执行器上的力传感器，如图4所示。这可以通过夹子或如此处所示的少量热胶来完成。
8. 一旦连接，Z轴最初张紧以优化剥离角度，同时不会过度张紧到剥离开始点（由力传感器测量的力的增加表示）。
9. 正确定位后，将力和位置传感器归零。＆nbsp;
10. 在开始剥离之前，将剥离实验的参数（包括速度和剥离距离）编程到软件中。
11. 在剥离过程中，以与Z轴相同的速度移动X轴，以使剥离尖端相对于剥离网格保持90度角（视频1）。
12. 在测定期间记录剥离位置并在剥离过程中将传感器数据强制（每秒5,000个样品）放入Excel文件中。
13. 一旦剥离到达剥离网的末端，就终止运动。
  
  图4.在气道培养物上剥离网状物以进行粘附强度测量
  
  视频1.粘附力测试。该视频显示了在粘合强度测量过程中，气道培养细胞表面的网状物（带有嵌入的粘液）的剥离。
粘液凝聚试验
1. 对于内聚力测量，将静态网格的双面胶带（在上面的方案D中制备）粘附到剥离测试装置的底部（图5）。这里，重要的是该网格平行于剥离机器的X轴放置，因为轴外剥离可能潜在地改变记录的力。
2. 小心地将粘液的测试样品放在底部网格上，然后使用弯曲的移液管尖端展开该层以确保完全网状覆盖。
  注意：我们之前对气道粘液（和痰痰）的研究表明，粘性强度对粘液厚度不到2毫米不敏感。在我们先前的研究中，我们通常使用~5μl/ cm 2 网眼表面积（，，0.5 mm厚）的体积。根据粘液浓度，薄层（，，<1 mm）对于最大限度地减少剥离操作过程中网格可能的滑动非常重要。
3. 然后将相应尺寸的果皮网轻轻放在下部网眼的顶部并进行取样。＆nbsp;
4. 在湿润良好的样品室中孵育样品和网孔至少30分钟。
5. 与粘附力测量一样，网格“尾部”位于力传感器下方并连接到传感器（图5），然后拉紧Z轴以优化剥离角度，同时不会过度张紧。＆nbsp;
6. 正确定位后，将力和位置传感器归零。＆nbsp;
7. 以所需速率记录剥离力的数据记录在Excel文件中（视频2）。
8. 一旦剥离到达剥离网的末端，就终止运动。
  
  图5.粘液强度测量的设置。注意力传感器效应器的位置直接位于剥离网的末端上方。
  
  视频2.内聚剥离。该视频显示了在内聚强度测量过程中顶部网格（剥离网格）从底部网格（静态网格）剥离。＆nbsp;

数据分析

对于每次粘附和内聚研究，Labview软件生成测量力与剥离距离的Excel文件。图6显示了所得内聚数据的示例跟踪（来自粘附研究的数据类似）。因为获得的力与网格的横截面宽度成正比，所以结果应除以所用网格的网格宽度，从而允许实验之间的可比较结果。例如，在图6中，数据被绘制为每cm宽度mN。这对于手工切割的网状网特别重要。
＆NBSP;通常存在两个可识别区域，即初始剥离裂缝裂缝峰值，然后是稳态剥离区域。这些区域如图6所示。这些区域之间的边界由初始峰值之后的斜率的正变化的位置确定（在图6中在1mm剥离距离处观察到）。注意，通常观察到稳态剥离期间数据的变化，并且与真实生物粘液样品中的性质异质性相关。然后，在稳态剥离期间获得的数据可以在每次测定中平均为单个值（对于该实例，内聚强度为2.61±0.24mN / cm）（Button 等人，2018）。该设备/测量的技术可变性非常低，使我们能够非常准确地测量水的表面张力（参见C部分的校准信息）。然而，根据以前的研究，我们建议平均3到6次重复测量，以克服培养粘液（或痰痰）的天然生物变异性。我们以前使用这些技术来生成数据，证明粘液的粘附强度和内聚强度高度依赖于粘液浓度和剥离速度（参见Button et al。，2018）。

图6.内聚力传感器数据示例（以mN / cm宽度绘制）与以100μm/ s速率撕裂的粘液距离

致谢

我们要感谢Drs。 Michael Rubinstein和Richard C. Boucher为研究设计提供帮助。我们也承认UNC Marsico Lung Institute Tissue Core用于细胞培养。该项目由囊性纤维化基金会（Grants BUTTON07XX0，RUBINS09XX0和BOUCHE15R0），NIH（Grants R01HL125280，R01HL136961，P01HL108808和P30DK065988）和NSF（Grants EFMA-1830957和DMR-1121107）资助。该协议改编自Button 等人（2018）。

利益争夺

没有列出任何作者。

伦理

来自北卡罗来纳大学囊性纤维化组织培养核心的HBE细胞在UNC机构审查委员会批准的方案的支持下使用先前报道的方法获得。

参考

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Button，B.，Cai，L.H.，Ehre，C.，Kesimer，M.，Hill，D.B.，Sheehan，J.K.，Boucher，R。C. and Rubinstein，M。（2012）。通过将粘液层与气道上皮分开来促进肺部健康。 < em> Science 337（6097）：937-941。
Button，B.，Goodell，HP，Atieh，E.，Chen，YC，Williams，R.，Shenoy，S.，Lackey，E.，Shenkute，NT，Cai，LH，Dennis，RG，Boucher，RC和Rubinstein ，M。（2018）。粘液粘连和咳嗽清除中凝聚力的作用。 Proc Natl Acad Sci美国 115（49）：12501-12506。
Fulcher，M.L。，Gabriel，S.，Burns，K.A.，Yankaskas，J.R。和Randell，S.H。（2005）。分化良好的人气道上皮细胞培养物。 Methods Mol Med 107：183-206。
Hill，D.B.，Vasquez，P.A.，Mellnik，J.，McKinley，S.A.，Vose，A.，Mu，F.，Henderson，A.G.，Donaldson，S.H.，Alexis，N.E.，Boucher，R。C. and Forest，M.G。（2014）。粘液固体浓度作为气道疾病候选生物标志物的生物物理基础。 PLoS One 9（2）：e87681。
Holden，J。K.，Nguyen，R。H.，Francisco，E。M.，Zhang，Z.，Dennis，R。G. and Tommerdahl，M。（2012）。用于研究体感信息处理的新设备。 J Neurosci Methods 204（2）：215-220。
国际，A。（2010年）。有源标准ASTM D3330 / D3330M-04（2010），压敏胶带剥离粘合力的标准试验方法。
Matsui，H.，Grubb，B.R.，Tarran，R.，Randell，S.H.，Gatzy，J.T。，Davis，C.W。和Boucher，R.C。（1998）。在囊性纤维化气道疾病的发病机制中，睫状液液层耗尽，而非异常离子成分的证据。 Cell 95（7）：1005-1015。
Repka，M.A.，Gutta，K.，Prodduturi，S.，Munjal，M。和Stodghill，S.P。（2005）。含有利多卡因的纤维素热熔挤出薄膜的表征。 Eur J Pharm生物制药 59（1）：189-196。
Randell，S.H.，Fulcher，M.L.，O'Neal，W。和Olsen，J.C。（2011）。囊性纤维化的原发性上皮细胞模型研究。囊性纤维化（第285-310页）。 Humana Press。