材料和试剂

1,000μl移液器吸头（海王星，目录号：89425-640）
200μl移液器吸头（海王星，目录号：89140-900）
10μl移液器吸头（海王星，目录号：89140-900）
1.5 ml微量离心管（VWR，目录号：20170-650）
60毫米培养皿（Santa Cruz Biotechnology，目录号：351863）
25毫升血清移液管（VWR，目录号：89130-900）
0.22μm过滤器（Corning，目录号：430767）
Caenorhabditis elegans （N2，来自CGC的野生型）
Triton X-100（Fisher Scientific，目录号：AC327371000）
NaCl（Fisher Scientific，目录号：BP358-1）
酵母提取物（BD，目录号：212750）
胰蛋白胨（BD，目录号：211705）
蛋白胨（BD，目录号：211677）
琼脂（BD，目录号：214530）
乙醇200证明（Greenfield Global，目录号：111000200）
胆固醇（200mg乙醇中5mg / ml）（Sigma-Aldrich，目录号：C8667-1G）＆nbsp;
CaCl 2 （1M，无菌过滤器）（VWR，目录号：97062-590）
MgSO 4 （1M，无菌过滤器）（VWR，目录号：IC191422.5）
KH 2 PO 4 （1M，无菌过滤器）（VWR，目录号：71003-456）
K 2 HPO 4 （1M，无菌过滤器）（VWR，目录号：470009-788）
Na 2 HPO 4 （VWR，目录号：470302-662）
二甲基亚砜（DMSO）（VWR，目录号：97061-250）＆nbsp;
羰基氰 - 对 - 三氟甲氧基苯腙（FCCP）（在DMSO中192μM）（Sigma-Aldrich，目录号：C2920-10MG）
磷酸钾缓冲液（见食谱）
M9缓冲液（见食谱）
用于OP50细菌的LB肉汤（见食谱）
NGM板（见食谱）

设备

1毫升移液器（Eppendorf，目录号：3123000063）
200μltipetman（Eppendorf，目录号：3124000083）
20μltipetman（Eppendorf，目录号：3124000032）
海马细胞外通量分析仪（XFe24分析仪）（安捷伦）
Seahorse XF24 FluxPak（安捷伦，产品目录号：100850-001）
注意：它包含18个XF24传感器盒，20个XF24细胞培养微孔板和1瓶海马XF Calibrant Solution 500 ml。
20°C孵化器（VWR，目录号：10753-894）＆nbsp;
移液器控制器（Brandtech Scientific Inc.，目录号：26333）

软件

Seahorse XF24分析仪软件（安捷伦）
Microsoft Excel或后实验分析所需的任何其他电子表格程序。

程序

注意：为了测量氧气消耗量，我们采用了已发布的协议（Dancy等，2016）。

在用OP50发现的NGM板上，在20°C下生长蠕虫。每种条件挑选300只L4阶段的蠕虫以同步实验动物并根据需要对它们进行老化。实验动物应至少在第二代生长在不拥挤，未处理和未受污染的环境中。

在实验当天之前
1. 校准传感器盒
  传感器盒有三个部分：盖子，盒子本身包含底部的探针和用于在顶部添加药物的端口，以及放置盒子的24孔板。在每个孔中加入1ml校准溶液。将24孔板在37℃下孵育过夜。＆nbsp;
2. 确保Seahorse XF24上的加热器已关闭。理想情况下，进行实验的房间的温度理想情况下应不超过20°C，当然不高于23°C，以防止蠕虫受到热冲击。
在实验当天
1. 如果仅评估基础呼吸，请从步骤B2开始。要评估最大呼吸，使用线粒体氧化磷酸化解偶联剂FCCP，不需要其他药物。将75μl的192μMFCCP吸入每个孔可用的4个端口之一（图2）。为了将FCCP同时释放到每个孔中，将FCCP分配到每个孔的相同端口（图2）。虽然野生型蠕虫会对此剂量的FCCP产生反应，但突变菌株可能需要进行一些优化。
  
  图2.探针板的示意图。 24孔传感器盒的（A）侧视图和（B）俯视图，其中传感器位于中心，注射端口位于化合物位于每个孔的外围。添加化合物时，为每个孔选择相同的进样口，即相同颜色的端口。
2. 确保设备处于室温并关闭加热器（图3）。
  
  图3.关闭Seahorse X24中加热器的说明。 A.程序打开后会出现此屏幕。选择“标准”模式（红色圆圈），在（B）中打开屏幕。 B.选择“仪器”（红色圆圈），在（C）中打开屏幕。 C.选择“管理”（红色圆圈），在（D）中打开屏幕。 D.选择“温度。控制“（红色圆圈），在（E）中打开屏幕。在最后一个屏幕中，应点击“ON”旁边的圆圈，直到它显得暗淡，类似于图形，然后在该屏幕上选择“确定”。
3. 使用墨盒运行校准程序。
4. 每孔加入450μlM9，制备XF24细胞培养微孔板。＆nbsp;
5. 准备蠕虫：
  蠕虫往往会粘在塑料上，因此在抽吸和排出蠕虫之前，始终需要用M9中的0.1％Triton X-100清洗塑料移液管尖端和离心管。
  1. 通过在M9中加入1ml 0.1％Triton X-100预洗涤离心管。取出溶液，用1000 ml塑料移液器吸头替换为1 ml M9。＆nbsp;
  2. 将300个蠕虫放入微量离心管中。
  3. 轻轻吸取蠕虫，以溶解与蠕虫一起转移的细菌团块。
  4. 让蠕虫通过重力沉降到1.5毫升微量离心管的底部，尽可能多地去除M9缓冲液和细菌。＆nbsp;
  5. 加入1ml M9缓冲液并重复步骤B5c和B5d两次。保留最后一次洗涤的上清液，用作步骤B5i的对照。＆nbsp;
  6. 向蠕虫中加入600μlM9缓冲液。
  7. 切断200μl尖端的末端以形成宽孔尖端。通过在溶液中上下移液，在0.1％Triton M9缓冲液中冲洗。＆nbsp;
  8. 轻轻地轻弹管子以混合蠕虫。将50μl移液到XF24细胞培养微孔板的孔中。记住每次将虫子移入井中之前都要轻弹蠕虫。每个样品应分成5个孔，每个孔含有约50个蠕虫。
  9. 将样品安排在XF24孔板中。
    1. 将四个孔A1，B4，C3和D6留空，用作对照（图4）。
    2. 将每个样品分配到板的随机部分（图4）。
      
      图4.具有空对照孔A1，B4，C3和D6的样品XF24孔板。该模板包含4种不同的条件[C1（橙色），C2（绿色），C3（黄色）和C4（橙色）]，每个条件重复5次（R1，R2，R3，R4，R5）。
  10. 用蠕虫拍摄每个孔的图像，以20倍放大率记录每个孔中的确切蠕虫数。理想情况下，应该有50到70个蠕虫。少于50个蠕虫可能导致更大的变异性，并且井中超过70个蠕虫可能导致对每个孔的蠕虫数量的不准确评估。＆nbsp;
  11. 将蠕虫在20°C下放置一小时。
6. 在XF24分析仪上设置程序如下（图5）：
  1. 10个循环，2分钟混合，2分钟休息，2分钟阅读。＆nbsp;
  2. 在评估最大容量时，添加一个步骤以注入端口并添加10个循环的2分钟混合，2分钟静止，2分钟读数。
  图5.用于获取最大呼吸能力的海马XF24协议。请注意，仅在评估基础呼吸时，应删除步骤8-13。＆nbsp;

数据分析

为了分析XF24 Analyzer软件中的数据，将结果导出为Microsoft Excel格式，并在Microsoft Excel中执行以下步骤：

将软件生成的每口井的耗氧量值标准化为每口井每个时间点的蠕虫数量。＆nbsp;
获得基础呼吸率：＆nbsp;
1. 对于每个井，平均每个蠕虫的每个井的氧消耗率（在数据分析的步骤1中计算）对于循环3或4到10。
  注意：可能会跳过前两到三个读数，因为当蠕虫调整到新环境时，初始读数可能会有噪音。
2. 平均每种条件下所有5口井的基础呼吸率。
3. 当包括至少三个技术重复时，数据可以表示为具有平均值±SEM的条形图。可以执行未配对的 t - 测试以确定重要性。＆nbsp;
获得最大呼吸能力：
1. 对于每个孔，平均循环3或4到10的氧消耗速率。＆nbsp;
2. 然后，对于每个孔，在添加FCCP后识别十个读数中的峰值响应。＆nbsp;
3. 平均峰值读数的氧消耗率和它之前和之后的两个读数。＆nbsp;
4. 将前一步骤中获得的平均耗氧率除以步骤（a）中获得的耗氧率。＆nbsp;
5. 平均每个条件下所有5个孔的最大呼吸能力。当至少进行三次技术重复时，数据可以用平均值±SEM表示。可以执行未配对的 t - 测试以确定重要性。＆nbsp;
控制测量残留细菌对氧气消耗率的影响。
1. 细菌对XF24分析仪软件确定的耗氧率的影响。
  1. 收集来自步骤B5e中的蠕虫制剂的第二次洗涤并在孔上运行以与洗涤的动物的呼吸进行比较。
  2. 图6显示在第二次洗涤中具有残留细菌的孔中的氧消耗基础速率小于孔中单个蠕虫的氧消耗的0.003％。该图以对数标度显示了第二次洗涤中的蠕虫和残留细菌的耗氧率，以使值可见。
    
    图6.蠕虫制备中的残留细菌对呼吸测量的影响很小。 A.使用对数标度来显示含有蠕虫的孔中的每只蠕虫的氧消耗率（OCR）（绿色）和含有残留细菌的孔（橙色）。表示每孔10个读数的平均值和标准偏差。最后一列表示来自三个含有30,45和87个蠕虫的孔的数据的平均值。 B.含有在（A）中测定的蠕虫的孔的图像。
2. 每口井动物数量不同的影响：
  1. 将不同数量的动物放入孔中并测定基础氧消耗率。＆nbsp;
  2. 图7显示氧消耗速率与每孔动物数量之间存在很强的相关性。
    
    图7.基础呼吸与每孔5日龄野生型蠕虫的数量线性相关

食谱

磷酸钾缓冲液
将足够的1 MK 2 HPO 4 添加到400ml的1M KH 2 PO 4 中以获得pH 6.0解决方案
注意：每次制作溶液时，1 M K 2 HPO 4 的数量可能会有所不同。
M9缓冲区
1. 加入3g KH 2 PO 4 ，6g Na 2 HPO 4 ，5g NaCl，1ml 1 M MgSO 4 并用蒸馏水将溶液加至1L
2. 使用0.22μm过滤器（Corning）对溶液进行过滤灭菌
用于OP50细菌的LB肉汤（来自CGC的OP50）
1. 将10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨加入1L蒸馏水中
2. 通过高压灭菌消毒20分钟
3. 不要使用任何抗生素
NGM板块
1. 将3g NaCl，2.5g蛋白胨，17g琼脂加入1L蒸馏水中
2. 通过高压灭菌消毒20分钟
3. 将介质冷却至55°C
4. 加入1毫升5毫克/毫升胆固醇，1毫升1M CaCl 2 ，1毫升1M MgSO 4 和25毫升磷酸钾缓冲液＆nbsp;
5. 将10毫升混合并倒入60毫米的盘子中
6. 在含有NO抗生素的37°C培养箱中以200rpm振荡的LB肉汤中开始过夜培养OP50
7. 第二天，使用25ml血清移液管观察4-5滴OP50的过夜培养物

致谢

这项工作得到了NIH（R01-GM124532至M.V .; CA204894和ES026222至J.H.B.）的资助，NIEHS（T32-ES019851至C.F.）的资助以及UPenn（FP20457至M.V.）的试点奖励。

利益争夺

本出版物的内容不一定代表NIH的官方观点。

参考

Dancy，B.M.，Brockway，N.，Ramadasan-Nair，R.，Yang，Y.，Sedensky，M。M. and Morgan，P.G。（2016）。谷胱甘肽S-转移酶介导对线粒体功能障碍的衰老反应。 Mech Aging开发 153：14-21。
Kraytsberg，Y.，Kudryavtseva，E.，McKee，A.C.，Geula，C.，Kowall，N.W。和Khrapko，K。（2006）。线粒体DNA缺失很多，导致老年人黑质神经元功能受损。 em> Nat Genet 38（5）：518-520。
Saneto，R。P.和Sedensky，M。M.（2013）。儿童期线粒体疾病：mtDNA编码。 Neurotherapeutics 10 （2）：199-211。
Wallace，D.C。（2005）。代谢和退行性疾病，衰老和癌症的线粒体范例：进化医学的曙光。< / a> Annu Rev Genet 39：359-407。
Wanagat，J.，Cao，Z.，Pathare，P。和Aiken，J.M。（2001）。线粒体DNA缺失突变与节段性电子传递系统异常，肌纤维萎缩，纤维分裂和氧化共定位肌肉减少症的损害。 FASEB J 15（2）：322-332。